ANWENDUNG VON ZONENPRÄZIPITATION DURCH MOLEKULARFILTRATION*

ANWENDUNG VON ZONENPRÄZIPITATION DURCH MOLEKULARFILTRATION*

von

J.

HOLLo,-E. L . .(szLo,--A. HoscHKE,-Zs. BANKY

Lehrstuhl für Landwirtschaftlich-chemische Technologie, Technische Universität.

Budapest

Eingegangen: am 2. Februar, 1970.

Einleitung

Zu den interessanten eigentümlichen Methoden der Molekularfiltration gehören diejenigen Methoden, wo der Trennungsmechanismus durch weitere molekulare Wechselwirkungen der zu trennenden Substanzen (Löslichkeit, Komplexbildung usw.) verbessert wird.

Eines dieser Anwendungsgebiete stellt die Zonenpräpizitation dar [1].

Hier wird heim Beginn des Chromatographierens im Gelbett eine Konzentra- tionsgradiente eines zur Ausfällung der Eiweißstoffe geeigneten Reagens von niedrigem Molekulargewicht (z. B. Ammoniumsulfat) zustandegebracht, dann das Gemisch der Eiweißstoffe aufgetragen. Die über hohes Molekulargewicht verfügenden Eiweiße werden aus dem Raumnetz des entsprechenden Geltyps ausgeschlossen, sie be"wegen sich während des Eluierens schneller als die Gra- diente des Fällungsmittels und scheiden ihrer Löslichkeit entsprechend bei einer bestimmten Strecke der Konzentrationsgradiente aus. Nach Verdünnung des Eluiermittels gehen sie dann wieder in Lösung. So läßt sich ein der relativen Löslichkeit entsprechendes Fraktionieren, durch öfteres Wiederholen eine Trennung der Komponenten des Proteingemisches erzielen. Grundlegende V oraussetzung ist, daß Ausfallen und Auflösen des Eiweißgemisches rasch und reversibel yor sich gehe. Bei geeigneter Porösität des Molekularsiebes sind die Gele nicht nur Träger des Fällungsmittels, sondern erhöhen auf Grund des ursprünglichen Gelfiltrationeffekts auch die Wirksamkeit der Zonen- präzipitation .

V ol'hel'eituug und aualytische Methoden

Bei der Herstellung des Kartoffelsaftes wurde eine Behandlung mit Dithionit zur Behinderung der Phenoloxydase unternommen, weiterhin Zitrat- pufferlösung yon pH Wert 6 benutzt [2]. Der Eiweißgehalt der erhaltenen Lösung betrug 20 mg/mI, die Alfa-1,4-glukan-phosphorylase Aktivität 161 Enzymeinheitenjml. Das Vorfraktionieren des Saftes erfolgte mit Ammonium-

* Prof. Dr. Laszl6 Erdey zum 60. Geburtstag gewidment.

92 J. HOLLO u. -'Ii'arb.

sulfat zwischen Dichtegrenzen yon 1,085-1,152, 1,095 1,145, 1,100-1,140 und 1,100-1,135 gjml [2]. Die spezifische Aktivität des vorfraktionierten Produktes betrug 37,5 Phosphorylase-Enzymeinheitenjmg. Der Eiv.-eißgehalt wurde nach Folin [3] bzw. "während der Zonenpräzipitationen spektrophoto- metrisch bei 280 nm bestimmt [4].

Die Phosphorylase-Aktivität 'wurde nach Lee gemessen [4]. Zu den Ver- suchen 'wurden Dextrangele von verschiedener Porösität (Sephadex G-25, G-50, G-100) bzw. Molekularsiebe auf Polyacrylbasis (Biogel P-2, P-I0, P -150) in Form von Gelhetten von 40 X 1 cm in hydrophoben Säulen benutzt.

Die einzelnen Chromatographiersäulen wurden mit Ammoniumsulfat in Zitrat-

30r---__ __

%

2 5 t - - - _ ...

20+---__ ...

!5t---~

10

2e 4] /Tl!

Abb. 1. Ammoniumsulfat-Gradiente in FunktioJl der }[cnge des Eluiermittels bei verschiedenen .\1!sgangskonzentra tim1en Y01;' C"H.l)~SOl

pufferlösung (pR = 7) auf Konzentrationen von 15, 20, 25 bzw. 30% ein- gestellt. In die so yorbereiteten Säulen 'wurden 2 -2 ml dialysierte Eiweiß- lösung eingeführt und mit 0,01 m PufferlöEUng (pR

=

7) eluiert (Gesckwindig- keit 10 mllh). Die Salzkonzentration der Eluate wurde konduktometrisch bestimmt. Die Ammoniumsulfat-Gradienten sind in Abb. 1 dargestellt.

Vel'suchsergehnisse

Das Fraktionieren durch Zonenpräzipitation der Proteine im Kartoffel- saft bei Ausgangskonzentrationen von 15, 20, 25 und 30% des Ammonium- sulfats in Säulen a:us Sephadex G 25 ist in Abb. 2 dargestellt. (Aufgetragene Proteinmenge: 20 mg.) Wie zu sehen, erhielt man die größte Zahl von Protein- fraktionen bei einer Salzkonzentration von 15 %, ein Erhöhen der Salzkon- zentration verminderte die Wirksamkeit des Fraktionierens. Unter den gleichen

ANWENDUI'.-C ro.,· ZONENPRAZIPITATION 93

Verhältnissen erzielte man mit Molehllarsiebsäulen von Biogel-P-2 ebenfalls eine gute Eiweißtrennung, die jedoch einen anderen Charakter besaß (Abb. 3).

Hier erzielte man die schärfste Separation der in verschiedenem Maß löslichen Ei"weißstoffe bei Ammoniumsulfatkonzentrationen von 15 bzw. 20%.

Im folgenden 'wurde untersucht, ob die nach dem aus vielen Stufen bestehenden, zeitraubenden und mühsamen Fraktionieren mit Ammonium- sulfat angewandte Methode der Zonenpräzipitation zur Charakterisierung der Homogenität des erhaltenen Produkts bzw. zum weiteren Fraktionieren geeignet ist. Die mit 15, 20, 25 und 30%iger Ammoniumsulfatkonzentration

1,5 mg/tTlI

i,O 0.5

15

75t

1 n

~

',0 ,

0.5

1

J

i,..J I

~

I

on I

15%

30 40 50

J\

^25%

r ' .

^{\ ~}

1D 20 ^-;0 1.;0 50

'\'"

I "-

/ \

^30%

I/i \

.../.. \", -"""" =-:::0..0

2:] ~:J :[,

60

50

6D

~

..

^:7),

100

[Im'

50

100 50

100 50

100 50

Abb. 2. Pro tein- und AktiYitätsyerteilung an Sephadex G-25 bei verschiedenen Ammonium- sulfatkollzentrationen. Protein: 0 - - - 0 ; Akthität: 0- - - 0

erhaltenen Elutionskurven au Sephadex G-25 sind in Abb. 4, an Biogel P-2 in Abh. 5 dargestellt (aufgetragen: 6,6 mg Protein). Es läßt sich auf Grund der Ahbildungen feststellen, daß die vorfraktionierte Probe noch immer aus zwei Fraktionen von verschiedener Löslichkeit besteht, ohzwar die Menge der Verunreinigungen erhehlich vermindert wurde (Tab. 3).

Die ·Wirkung der verschiedenen Porösitäten wurde ebenfalls untersucht.

Die unter gleichen Verhältnissen mit Sephadex G-25, G-50, G-I00 hzw.

Biogel P-2, P-I0, P-150 erhaltenen Fraktionierungsergehnisse sind in Ahb. 6 und 7 aufgezeichnet. Die charakteristischen Fraktionen des auf die verschiedenen Säulen aufgetragenen Proteingemisches von 4,0 mg erhielt man

94

mg/mi 1.5 1,0 0,5

2.0 1,5 W 0,5

1,5 1,0 0,5

1,5 1,0 0,5

J. HOLLO u. J[itarb.

10

10

10

10

50 25

iDü 50 25

100 5J 25

JOD 50 25

Abb. 3. Protein- und Aktivitätsverteilung an Biogel P-2 bei verschiedenen Ammonium- sulfatkonzentrationen

Abb. 4. Protein- und Aktivitätsverteilung an Sephadex G- 25 bei verschiedenen Ammonium- sulfatkonzentrationen im Fall der Zonenpräzipitation vorfraktionierten Kartoffelsaftes

ASJVKYDUSG VOS ZOSE:YPRA'ZIPITATIO.Y 95

i,O 15% f/ml

mg/mir

0,5 100

10 20 30 40

1,0 20%

D5 ₁₀₀

10 20 3D 40

i.O _25%

a5 ₁₀₀

10 ₄₀

1,0 30%

0,5 100

10 20 30 1;0 ml

Abb. 5. Protein- und _-\.ktivitätsverteilung an Biogel P-2 bei verschiedenen Ammoniumsulfat- konzentrationen im Fall der Zonenpräzipitation vorfraktionierten Kartoffelsaftes

mg/mI um/

3 G-25

2 fOO

50

10 20 30 40 50 60

3 G-50

2 100

50 10 20 30 1;0 50 60 3

2 100

50

10 30 40 50 60 ml

Abb. 6. Zoncnpräzipitation von Kartoffelsaft an Sephadex G-25. G-50, G-IOO Sänlen

96 J. HOLLÖ u. Miloro.

bei den Eluaten von den mit G-25 bzw. P-2 beschickten Säulen, die Trennung der Phosphorylasefraktion war ebenfalls bei diesen Säulen die beste.

mg/~l

Bio-Gel-P-2 IEiml

100 50

10 30 50

3

Bio-Ge/-P-10

2 100

50

10 20 3D ~O 50

J

Bio-Gei-P-150

2 IOD

,.,

/\

I ' 50

I ~

~

I , l , ,

10 20 3D 1;0 50 ml

Abb. 7. Zonenpräzipitation von Kartoffelsaft an Biogel P-2, P-IO, P-150 Säulen

Besprechung der Ergebnisse

Die mit verschiedenen Ausgangsgemischen unter verschiedenen Verhält- nissen an verschiedenen Siebsubstanzen erhaltenen Elutionskurven ,,,-urden nicht nur hinsichtlich des Proteinfraktionierens sondern auch in Hinsicht auf die Kartoffelphosphorylaseausbeute unter:::ucht.

Aus diesem Gesichtspunkt ist die Separation des Enzymproteins in getrennter Fraktion mit größtmöglichster spezifischer Aktivität in dem Elu- tionsdiagramm der Eiweiße wichtig. Durch Zonenpräzipitation von Kartoffel- saft an Sephadex G-25 bzw. Biogel P-2 Säulen erhielt man die definierteste und separierteste Enzymfraktion mit 15 und 20%iger Ammoniumsulfatkon- zentration. Werden größere Gele angewandt (G-50, G-100, P-10, P-150), so erscheint zwar ebenfalls im ersten Elutionsmaximum das Enzym, doch erhalten diese Fraktionen mehr Verunreinigungen. Im Falle eines vorfraktionier- ten Proteingemisches gab hingegen an Sephadex G-25 eine 20%ige, an Biogel P-2 eine 15%ige Ammoniumsulphatkonzentration die beste Trennung.

Tabelle 1

Spezifische Phosphorylase-_-\.ktivität bei der Zonenpräzipita tion von Kartoffelsaft.

(Spezifische _-\.ktivität im Saft: 8,05 Einheit/mg)

Ammoniumsulfat ..

Konzentration

0' ,0

15 20 25 30

Spezifische Akth~tät (E/mg) Sephadex G-:!5

32,5 31,0 31,2 19,9

Biogel-P .. 2

25,2 25,2 20,3 16,8

97

Enzymreinheit ist durch die spezifische Aktivität charakterisiert. Die aus den bei Zoncnpräzipitation des Kartoffelsaftes erhaltenen Elutionskurven bei verschiedenen Ammoniumsulfatkonzentrationen an Sephadex G-25 bzw.

Biogel P-2 gerechneten spezifischen _i\..ktivitätswerte sind in Tab. 1 zusammen- gestellt. Die Daten bezeugen ebenfalls die Anwendbarkeit von 15- bzw. 20%iger Ammoniumsulfatkonzentrationen.

Dieselben Daten bei Verwendung von verschiedenartigen Molekular- sieben sind in Tab. 2 zu sehen. Die höchste Enzymreinheit erzielte man bei niedrigster Porösität (G-25 bzw. P-2).

Die im Falle der Zonenpräzipitation vorfraktionierter Kartoffelproteine erhaltenen spezifischen Phosphorylase-Aktivitäten zeigt Tab. 3. Wie zu sehen, erhält man das reinste Enzympräparat mit 20%iger Ammoniumsulfatkon- zentration. Dextrangel (Sephadex) "war günstiger als Polyacrylgel (Biogel).

Tabelle 2

Spezifische Phosphorilase-Aktivität be i verschiedenen Gelen.

Kartoffelsaftaktivität: 8,05 Einheit/mg

Gelart

Sephadex G-25 G-50 G-100 Biogel P-2

P-10 P-150

Spezifische A.ktivität (Einheitjmg)

32,5 21,3 16,4 25,5 22,7 18,2

98 J. HOLLO u . .1Ii.arb.

Tabelle 3

Anderung der spezifischen Aktivität vorfraktionierter Proben.

(V or der Zonenpräzipitation: 37,5 Einheit/mg)

~-\.mmoniumsulfat Konzentration (%)

Spezifische Aktivität Einheit/mg

15 20 25 30

Sephadex G·25

103,5 148,5 58,5 50,5

Zusammeufassuug

Biogel P·2

86,5 94,5 51,0

·!6,0

Es wurden Eiweißfraktionierungen an verschiedenen Molekularsieben (Dextrangelen und Polyacrylgelen) durch Zonenpräzipitation von Kartoffelsaft nnd von mit Ammonium- sulfat vorfraktioniertem Kartoffelsaft mit einstufiger linearischer Salzgradiente unternommen.

Beiderlei Siebarten (Sephadex und Biogel) wurden zum Zwecke der Fraktionierung geeignet gefunden, die besten Ergebnisse lieferten Sephadex G-25 und Biogel P-2. Aus der Reihe der Kartoffelproteine dienten zum Reinigen von 1,4-Glukanphosphorylase 15- und 20%ige Ansgangskonzentrationen am besten. Durch Zonenpräzipitation kann eine mit Ammonium- sulfat weiter nicht mehr reinigbare Fraktion noch auf das 2,6-4fache angereichert werden.

Ohne Vorfraktionieren mit Ammoniumsulfat ist die Selektivität der :iYIethode geringer.

Literatur 1. PORATH, J.: Adv. in protein ehemist:.:y 17, 209 (1962).

2. HOLLO, J.-LisZLO, E.-HOSCHKE, A.: Die Stärke 16,243 (196.J.).

3. FOLIN, O.-CIOCALTEU, V.: J. Biol. Chem. 73, 627 (1927).

4. LEE, Y. P.: Biochem. biophys. Acta 43, 18 (1960).

Prof. Dr. lanos HOLLO

Dr. Elemer L\SZLO

Dr. Agoston ^HOSCHKE Zsuzsa ^R\NKY

Budapest XI., Gellert ter 4. Ungarn