Fehérjék stabilitása
Géntechnikák Laboratórium
2008. 03. 13
Centrális dogma
DNS RNS Fehérje
Replikáció Transzkripció Transzláció
Fehérje
A fehérjék aminosavak lineáris polimereiből felépülő szerves makromolekulák. A fehérjék aminosav sorrendjét a gének nukleotid
szekvenciája kódolja a genetikai kódszótárnak megfelelően.
A fehérjestabilitás értelmezése-1
A biofizikusok a termodinamikai stabilitást értelmezik, mely szerint
fehérjék reverzibilisen alakulnak át a natív és a denaturált forma között.
Ebben az esetben a stabilitás leírható a két állapot között Gibbs- féle szabadenergia különbséggel:
Minél nagyobb a különbség, annál stabilabb a fehérjeállapot.
Jellemzően egy globuláris fehérjére ez a különbség viszonylag kicsi, Kb. 15kcal/mol.
A fehérjestabilitás értelmezése -2
A biokémikusok, biotechnológusok szempontjából kérdés, hogy
adott körülmények mellett elég stabil-e funkciójának (pl. enzimaktivitás
membrántranszport, szerkezetalkotás, stb.) ellátásához. Ha egy fehérje pl. a hőmérséklet emelésével denaturálódik, de a változás reverzibilis, a fehérjét
funkcionális szempontból stabilnak nevezzük, míg termodinamikai szempontból a molekula instabilnak tekinthető. Irreverzibilis denaturáció esetén azonban az is fontos, hogy adott környezetben milyen gyorsan megy végbe a változás.
Ilyen szempontból a változás sebességét kinetikus stabilitásként értelmezzük:
A kinetikailag stabil fehérje átalakulásához nagyobb szabadenergia gát átlépése
szükséges, az instabil állapot elérése több lépésben történhet :
A fehérjestabilitást befolyásoló faktorok
1. Hidrofób kölcsönhatások 2. Hidrogénkötések
3. Konformációs entrópia 4. Ionos kötések
5. Aromás kölcsönhatások 6. Fém-kötések
7. Diszulfid hidak
Fehérjék denaturációja
• Okai: fizikai vagy kémiai behatások
• Fizikai:
– Hő
– UV-sugárzás
– Radioaktív-sugárzás
• Kémiai:
– pH
– Nehézfémek sói
– Fertőtlenítőszerek
– Formaldehid stb.
Célunk a stabilitás növelésénél, hogy a fehérjék jobban elviseljék:
• Magasabb hőmérsékletet
• Extrém pH-t
• Extrém redoxpotenciált
• Szerves oldószert
Stabilitást növelő eljárások
• stabilizálás során az enzimet valamilyen eljárással rögzítik a vízben oldható vagy oldhatatlan anyagokhoz
• az enzimet kémiailag módosítják
• különbözô adalékok (additívek), mint például cukrok és más poliolok (glicerin, glikol)
alkalmazása
• megtaláljuk a fehérjemolekulát kódoló
génszakaszt és ezen a génszakaszon hozunk
létre mutációkat
A fehérjék konformációváltozásának vizsgálatára
alkalmas módszerek
• Fluoreszcens spektroszkópia
• Cirkuláris dikroizmus (CD)
• Röntgen diffrakció
• NMR
• Differenciál pásztázó kalorimetria (DSC)
• Fourier-transzformációs infravörös spektorszkópia (FTIR)
A fehérjék konformációváltozásának vizsgálatára alkalmas módszerek
Cirkuláris dikroizmus
A CD spektroszkópiával egyszerűen és gyorsan nyerhetünk információt a fehérjék szerkezetéről, illetve szerkezetváltozásáról (pl. szubsztrátkötés, oligomerizáció, denaturáció, stb.). A távoli ultraibolya (UV) tartományban (180-260nm) felvett CD spektrumból következtethetünk a másodlagos szerkezeti elemek ( -hélix, -szerkezet, rendezetlen/random coil láncok) meglétére, illetve ezek arányára a fehérje térszerkezetében, míg a közeli UV tartomány (260-320 nm) az aromás oldalláncokról, azok egymáshoz viszonyított térbeli orientációjáról, vagyis a harmadlagos szerkezetrõl ad információt.
A fehérjék konformációváltozásának vizsgálatára alkalmas módszerek
Röntgen diffrakció
Ahhoz, hogy mérhető röntgenszórást tapasztaljunk, sok ezer milliárdnyi fehérjemolekulából rendezett mintát kell előállítanunk.
Általában ez azt jelenti, hogy a fehérjét kristályosítani kell. A
fehérjék kristályosítása egyáltalán nem triviális feladat. A tapasztalat mégis azt mutatja, hogy megfelelő körülmények között a legtöbb
fehérje kristályosítható.
A fehérjék konformációváltozásának vizsgálatára alkalmas módszerek
NMR-spektroszkópia
Az NMR spektroszkópiás szerkezetvizsgálat szerencsésen
kiegészíti a röntgendiffrakciós analízist, mert nem igényel rendezett mintát, s természetes, vizes környezetükben képes tanulmányozni a fehérjéket. Hátránya viszont, hogy ezzel a módszerrel nagyobb
méretű - jelenleg 300 aminosvnál hosszabb - fehérjék nem tanulmányozhatók.
A fehérjék konformációváltozásának vizsgálatára alkalmas módszerek
Differencial pásztázó kalorimetria (DSC)
