MIKOTOXINOK MONITORINGJA MUSTOK ÉRÉSI FOLYAMATÁBAN
Csutorás Csaba
1– Rácz
1László – F Ħ t Ę Péter
1– Forgó Péter
1– Kiss Attila
1– Tajcs Zsolt
2–Rácz Kinga
21Élelmiszertudományi Intézet, Eszterházy Károly FĘiskola, H-3300 Eger, Leányka u. 6.
Email: csuti@ektf.hu
2 Egri Korona Borház Kft., H-3395 Demjén 0183/5 hrsz.
Abstract: Monitoring myco-toxins in the fermentation process of must Ochratoxin A (OTA) and aflatoxin B1 (AFB1) are the most abundant and the most toxic among toxins. The International Agency for Research on Cancer has classified ochratoxin A as a possible human carcinogen (category 2B). The oc- currence of OTA and AFB1 in wine samples has been reported in various studies predominantly dealing with European wines but also with wines of other re- gions. Generally red wines seem to contain a higher amount of OTA than white or rosé wines, and some results suggest, that at least for European and North African cultivation areas, southern regions are more affected by the contamina- tion problem. The aim of the present work was to investigate the change of OTA and AFB1 content during must fermentation processes, using artificial contamination of must samples with OTA and AFB1 of higher than 98% purity.
Different concentrations of the toxins combined with different sort of wines (white, rosé, red) were applied. Our experiments were carried out in laboratorial as well as in industrial scale, and demonstrated the level of OTA and AFB1content in must and wine during fermentation. Sample collections and preparations were carried out systematically, the prepared samples were analyzed by HPLC-MS and by HPLC.
1. Bevezetés:
Az Ochratoxin A-t bor kontaminánsként elĘször 1996-ban detektálták, Euró- pában 1999-ben [1]. Az Európa szerte végzett kutatások kimutatták, hogy az Asp. carbonarius a leginkább felelĘs az OA termelésért a szĘlĘkben, borkészí- téshez használt gyümölcsökben és borokban. Európában végzett boranalízisek bebizonyították, hogy az OA koncentrációja csökkenést mutatott, a vörösbor tartalmazza a legtöbbet, a rozé és a fehér bor elĘtt. Európában sajnos kevesen tudják azt, hogy a fĘbb klímaviszonyok a betakarítást megelĘzĘen szoros kap-
csolatban állnak a szĘlĘk, borok OA-tartalmával. Görögországban a száraz vö- rösbor OA-tartalma kevésbé különbözik a rozé és fehér borok toxintartalmától.
A cereáliák után a bor a felelĘs a napi OA bevitelért. A korai szĘlĘérés és a szü- retelés között eltelt idĘ, mint kritikus periódus és a faktorok képesek befolyásol- ni a gombák növekedését és az OA termelést. A meteorológiai állapotok megfe- lelĘ monitorozása szükségszerĦ ez idĘ alatt. Úgy tĦnik, hogy az OA nem szaba- dul fel teljesen a szĘlĘbĘl a bogyók zúzásakor, részben a macerálás növelheti még az OA mennyiségét, a fermentáció során viszont ez az érték csökken, mivel a keletkezĘ alkohol gátolja a gombák növekedését, így a toxintermelést is.
A borok OA-val való szennyezĘdését a penészgombák szĘlĘszemeken való megtelepedése okozza [2]. Annak ellenére, hogy a Penicillium verrucosum és az Aspergillus ochraceus tekinthetĘk a legfĘbb OA termelĘ fajoknak, mégsem ezek alkotják a szĘlĘ normál mikrobiótáját. Mellettük fĘképp az Asp. carbonarius és az Asp. niger a felelĘs a szĘlĘk, borok és a szárított, borkészítésre használt gyü- mölcsök szennyezéséért.
KülönbözĘ elfogadott szĘlĘtermesztési gyakorlatok, mint például peszticidek használata, eltérĘ termesztési módok, a leszüretelt szĘlĘ megfelelĘ körülmények közötti tárolása, elĘkészítések módjai, a fermentáció ideje és hĘmérséklete, mind-mind képesek befolyásolni a mikotoxinok felhalmozását/akkumulálását [3]. Mikotoxinok jelenléte borokban, gyümölcslevekben a nem megfelelĘ mezĘ- gazdasági eljárásnak köszönhetĘ. MegfelelĘ termesztési eljárások betartásával – megfelelĘ válogatás, kezelés, tárolás, szemezés és mosás – biztosítható, hogy a gyümölcslevek és borok nem tartalmaznak a megengedett értéknél több maradék mikotoxint.
Spanyolország vezetĘ helyen áll a minĘségi borok gyártásában [4]. Nagyjá- ból a világ bortermesztĘ vidékének 15%-a található itt, és a világ bor elĘállításá- nak 11%-át bonyolítják le ebben az országban. A spanyol borok több mint 50 csoportba sorolhatók, és mindegyik különbözik a másiktól. Úgy tĦnik, hogy néhány bor Európa déli borvidékeirĘl és Afrika északi borvidékeirĘl magasabb OA tartalommal rendelkezik, mint az északabbi területeken termelt borok.
Ugyanez elmondható Argentínára, Brazíliára és Franciaországra is.
A szennyezett borok OA-tartalma egyes anyagokkal megköthetĘ, csökkent- hetĘ, ilyenek például a zselatin, kazein, tojás albumin [5]. A kutatások eredmé- nyei azt mutatják, hogy az aktív szén egy hatékony ágens, mely felhasználható az OA eltávolítására pufferelt oldatokban, és fehér borban egyaránt, míg a ben- tonit kisebb affinitást mutat az OA megkötésére.
Számos tanulmány azt mutatta, hogy kapcsolat lelhetĘ fel az OA jelenléte és a fehérjeszintézis között [6]. Valójában az köztudott volt, hogy az OA nagy kon- centrációban DNS melléktermék keletkezéséhez és a kismag formációváltozásá- hoz vezethet, és megzavarja a sejt szintĦ fehérjeszintézist.
Újabb kutatások kimutatták, hogy a borok jelentĘs mértékben tartalmaznak OA-t [7]. Az OA borban való elĘfordulását elĘször Svájcban írták le. Az elmúlt
évtizedekben számos európai országban – Skandinávia, Mediterrán Tengeri Or- szágok, Balkán - kimutatták az OA jelenlétét borokban. Az OA mennyisége a borokban nagymértékben változó, ugyanis nagyban függ a borkészítés minĘség- irányításától. Egy kutatás keretében, Törökország négy egymástól nagyban kü- lönbözĘ klímájú területén készült borok OA tartalmát vizsgálták meg és hasonlí- tották össze. Azt tapasztalták, hogy a forró nyarú, magas páratartalmú mediter- rán területeken termelt borok OA tartalma volt a legmagasabb. Hasonló kutatá- sokat végeztek Spanyolországban és Olaszországban is, és az eredmények ha- sonlóan alakultak, mint a török példa esetén [8].
Fernandes és mts. kijelentették, hogy a must OA tartalma magasabb a boré- hoz képest, mert a biomassza jelenléte a mustban kedvezĘen hathat a felületén lejátszódó adszorpció révén az OA mennyiségének csökkenésére. Ezt a sejtfalak negatív töltési tulajdonságával és az OA savas tulajdonságával magyarázták.
Bau és mts.-i állították, hogy az OTA termelésének kockázata a szĘlĘ érlelésével csökken, ami azt jelenti, hogy megfelelĘ higiéniai állapot szükséges ahhoz, hogy a bort megóvjuk a szennyezéstĘl.
Az aflatoxinok az Aspergillus flavus, illetve Asp. parasiticus fonalas gombák által termelt erĘsen toxikus másodlagos anyagcseretermékek. Számukra kedvezĘ hĘmérsékletĦ és páratartalmú körülmények között bizonyos élelmiszereken, ételeken nĘnek, és mikotoxint termelnek. Az aflatoxinokat a mezĘgazdasági termékek természetes szennyezĘiként tartják számon. A legerĘsebb szennyezést kukoricában, mogyoróban, gyapotmagban, és más gabonanövényekben mutatták ki. Az aflatoxinok közül a legismertebb a B1, B2, G1 és G2 típus, melyek közül a B1 emelkedik ki, mint legveszélyesebb toxikus anyag. Az Európai Bizottság 2 ng/g-ban maximálta az aflatoxin B1 mennyiségét az élelmiszerekben, habár az új limitek 1 ng/g-ban határozzák meg ezt az értéket. Habár eddig nem volt elérhetĘ információ aflatoxin szĘlĘben való elĘfordulásáról, nemrégiben megjelent kuta- tások kimutatták az Asp. flavus nagyon alacsony számát mediterrán területekrĘl származó szĘlĘkben. Azonban az aflatoxin B1 mennyiségérĘl nincs adat az érte- kezésben [9]. A borvidék különbözĘ területeirĘl vett 10 szĘlĘfürtbĘl készült mintákat extrahálták és HPLC módszerrel, valamint standard használatával vizs- gálták a szĘlĘk aflatoxin B1 tartalmát 0,01 µg/l kimutatási határérték mellett.
Szerencsére csak a táptalajon nevelt gombáknál tapasztaltak toxintermelést, a borban nem.
Tunézia borvidékeirĘl vett szĘlĘminták aflatoxin B1 és ochratoxin A tartal- mát vizsgálták a kutatók [10]. Nagyjából 100 Aspergillus izolátumban az Asp.
niger 70%-ban, az Asp. carbonarius 7%-ban és az Asp. flavus 23%-ban fordult elĘ. Baktériumtenyészetekben tesztelték az izolátumok mikotoxintermelĘ képes- ségét. A legmagasabb OA termelési szintet az Asp. carbonarius izolátumok 80%-a produkálta, miközben az Asp. niger izolátumok csak 5%-a termelt OA-t.
Továbbá az Asp. flavus izolátumok 39% termelt AFB1-et 21–54 µg/g mennyi-
ségben. Továbbá elĘször demonstrálták, hogy a Penicillium izolátumok 3%-a mutatott OA termelést szĘlĘkben.
2. Eredmények:
Munkánk során laboratóriumi vizsgálati módszert fejlesztettünk ki fehér, rosé és vörös borok érési folyamatában az AFB1 és OA tartalom nyomonkövetésére.
A vizsgálati edényeink 4 literesek voltak, illetve a léptéknövelĘ kísérleteink elĘkészítéséhez 25 literes ballonokat is alkalmaztunk. Az említett Ħrtartalmú edényekbe kerültek a különbözĘképpen elĘkészített must minták (kénezéses elĘkészítéssel, vagy anélkül; kétféle fajélesztĘ adagolásával, illetve anélkül;
mindenféle elĘkezelés nélkül), melyekhez különbözĘ mennyiségĦ (0,5–1,0–2,0–
4,0 ppm) 99%-os tisztaságú AFB1, illetve OA toxinokat adagoltunk. A nyomonkövetési vizsgálatokban több idĘpontban mintavétel történt a must fer- mentációja során, a mustmintákat feldolgozásukig -18oC-on tartottuk (1–4. ké- pek).
1. kép: Mikotoxinnal szennyezett mustminták
2. kép: Mintavételezés a kísérleti mustmintákból
3. kép: Vizsgálati minták száma, címke minta képe a vizsgálatok nyilvántartásából
4. kép: Mintavételek száma, kivitelezése
A mélyfagyasztott mustminták feldolgozására sikerült egy egyszerĦ, gazda- ságos, hatékony módszert kidolgoznunk, mely mindkét típusú toxin esetében kiválóan alkalmasnak bizonyult. Az általunk kidolgozott mintaelĘkészítési eljá- rás során a következĘ lépéseket alkalmazzuk:
A 100 ml must, illetve bormintából 80 ml-t négyszeres extrakciónak vetünk alá, mely során acetonitrilt használunk oldószerként, minden extrakcióban 30-30 ml-t. A négy extrakcióból összegyĦjtésre kerülĘ oldószermennyiség általában 115-125 ml körül alakul. Az elválasztás megkönnyítése érdekében centrifugát használunk, 5 percig 3800 rpm sebességgel.
5. kép: MintaelĘkészítés a laboratóriumban
Az összegyĦjtött oldatot szárazra pároljuk rotációs vákumbepárló berendezé- sen, majd a visszamaradt anyagot 10 ml acetonitrillel visszaoldajuk, melybĘl 2 ml-t veszünk ki a további vizsgálat céljából. A kivett mintát újabb centrifugálás után, mely 10 percig 9000 rpm fordulaton történik, mélyhĦtĘben tároljuk. Az elemzés elĘtt a mintákat fecskendĘ elĘtétszĦrĘvel megszĦrjük úgy, hogy leg- alább 1,5 ml víztĘl és szilárd szemcséktĘl mentes acetonitril oldatot kapjunk, mely alkalmas HPLC, illetve HPLC-MS vizsgálatokra (5. kép).
A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerrel történĘ koncentrá- ció meghatározásához Shimadzu LCMS-2010 EV HPLC készüléket használ- tunk, diódasoros detektorral (DAD) kapcsolva (6. kép).
6. kép: HPLC-MS készülékünk
A 144 minta elemzésével kapott eredményeinket az 1-6. ábrákon tettük köny- nyen értelmezhetĘvé. Az ábrákat úgy csoportosítottuk, hogy egyszerĦen átte- kinthetĘek legyenek, illetve a szükséges következtetéseket levonhassuk az ábrák elemzésébĘl.
1. ábra: Mérési eredmények – 1. sorszám
2. ábra: Mérési eredmények – 2. sorszám
3. ábra: Mérési eredmények - 3. sorszám
4.ábra: Mérési eredmények – 4. sorszám
5. ábra: Mérési eredmények – 5. sorszám
6. ábra: Mérési eredmények – 6. sorszám
3. Az eredmények értékelése:
A mérési eredményeink nagyszerĦ képet mutatnak számunkra ezen két kü- lönbözĘ szerkezeti csoportba sorolható toxin különbözĘ viselkedésérĘl. Az aflatoxin B1 egyértelmĦen alacsonyabb fokú kockázatot jelent a borászati ter- mékpálya esetében, ami egyértelmĦen rossz víz oldékonyságában, illetve mérsé- kelt alkoholban való oldékonyságában keresendĘ. A mért legnagyobb mennyiség sem érte el a 0,8 ppm koncentrációt, mely az induló 0,1–0,3 ppm mennyiségek- rĘl a must érése során keletkezĘ alkohol hatására az érés kezdeti szakaszában növekedett, majd egy idĘ után a seprĘben kezdett újra halmozódni, míg az oldott mennyiség csökkent. Az említett 0,8 ppm mennyiséget is csak egy esetben köze- lítette meg az adott vizsgálati minta, míg a hozzáadott 4 ppm toxinmennyiség többi hányada már akkor is feltehetĘen a seprĘben gyĦlt össze. További vizsgá- latainkban a seprĘ elemzését is el kívánjuk végezni többek között ennek tisztázá- sára is.
Az ochratoxin A azonban a szakirodalmi várakozásainknak megfelelĘen vizsgálatainkban is fokozott oldékonyságával tĦnt ki, mind a vizes és méginkább az alkoholos oldatokban. A must érése során a két toxin hasonló viselkedést mutatott a tekintetben, hogy a kezdeti alacsonyabb mért értékek után az alkohol- tartalom növekedésével nagyobb koncentrációkat mértünk, mely egy mutatott maximum érték után csökkenĘ tendenciát kapott. Kiemelnénk, hogy a bor érése során fokozatosan csökken mindkét toxin mennyisége a borban, valószínĦleg a seprĘben ugyanilyen arányban növekszik. További vizsgálatainkban kívánjuk ezt igazolni, a seprĘbĘl vett minták analízisével.
A vizsgálati eredményeink egyértelmĦen igazolták, hogy mindkét toxin ese- tében az oldatba jutásának, illetve ott tartásának a feltétele nemcsak az alkohol- tartalomban keresendĘ, hanem közvetlen összefüggés mutatkozik az élesztĘ jelenléte és a toxin oldatba kerülése között. Az élesztĘ minĘségétĘl függĘen is változik a toxinok jelenléte a vizsgált mintákban, igazolhatóan a vadélesztĘk segítik leginkább, majd a vizsgált 1-es és 2-es számú fajélesztĘk következnek a sorban a toxinok oldatba kerülésének elĘsegítésében. A borászatokban napjaink- ban alkalmazott must-kénezés gyakorlatilag a vadélesztĘket eliminálja a borké- szítés során, ami kedvezĘ az elĘbb említett okokból is. Véleményünk szerint a délvidéki országokban, ahol a toxinszennyezés valós probléma, érdemes lenne megfelelĘ élesztĘtörzseket keresni, melyek a toxinok oldatba kerülését nem segí- tik, viszont a bor erjesztését elvégzik. Lényegesen befolyásolható lehet ilyen módon a borban lévĘ toxinok mennyisége, még esetlegesen toxinnal szennyezett must feldolgozásával is.
4. Köszönetnyilvánítás
A szerzĘk köszönetet kívánnak mondani a Nemzeti Fejlesztési Ügynökség- nek, hogy a munkát a GOP-1.1.1 pályázat keretében támogatta.
Irodalomjegyzék
1. P.Battilani, N. Magan, A. Logrieco: European research on ochratoxin A in grapes and wine; International Journal of Food Microbiology 111 (2006) S2-S4.
2. N. Bellí, M. Bau, S. Marín, M.L. Abarca, A.J. Ramos, M.R. Bragulat: Mycobiota and ochratoxin A producing fungi from Spanish wine grapes; International Journal of Food Microbiology 111 (2006) S40-S45.
3. N. Delage, A. d’Harlingue, B. Colonna Ceccaldi, G. Bompeix: Occurence of mycotoxins in fruit juices and wine; Food Control 14 (2003) 225–227.
4. M. Bau, M.R. Bragulat, M.L. Abarca, S. Minguez, F.J. Cabanes: Ochratoxigenic spe- cies from Spanish wine grapes; International Journal of Food Microbiology 98 (2005) 125–130.
5. Var, B. Kabak, Z. Erginkaya: Reduction in ochratoxin A levels in white wine, following treatment with activated carbon and sodium bentonite; Food Control 19 (2008) 592-598.
6. G. Meca, G. Blaiotta, A. Ritieni: Reduction of ochratoxin A during the fermentation of Italian red wine Moscato; Food Control 21 (2010) 579–583. 76.
7. I.Var, B. Kabak: Occurence of ochratoxn A in Turkish wines; Microchemical Journal 86 (2007) 241–247.
8. N. Ratola, E. Abade, T. Simoes, A. Venancio: Evolution of ochratoxin A content from must to wine in Port Wine microvinification; Anal. Bioanal. Chem. 382 (2005) 405–411.
9. EL Khoury, T. Rizk, R. Lteif, H. Azouri, M.L. Delia, A. Lebrihi: Fungal contamination and Aflatoxin B1 and Ochratoxin A in Lebanese wine-grapes and musts; Food and Chemical Toxicology 46 (2008) 2244–2250.
10. S. Melki Ben Frejd, S. Chebil, A. Mliki: Isolation and characterisation of ochratoxin A andd aflatoxin B1 producing fungi infecting grapevines cultivated in Tunisia;
African Journal of Microbiology Research 3(9) (2009) 523–527.
