Állati sejtkultúrák alkalmazása Állati sejtkultúrák alkalmazása a biotechnológiában a biotechnológiában

Állati sejtkultúrák alkalmazása Állati sejtkultúrák alkalmazása

a biotechnológiában a biotechnológiában

Előadó: Madár Zsuzsanna Előadó: Madár Zsuzsanna

Bevezető Bevezető

▪ ▪ a technológiának gazdag hagyományai vannaka technológiának gazdag hagyományai vannak

▪ ▪ vakcina gyártás (állati és emberi)vakcina gyártás (állati és emberi)

▪ ▪ állati szövetek felhasználása rekombináns fehérjék előállítására állati szövetek felhasználása rekombináns fehérjék előállítására (humán inzulin, növekedési hormon), kínai hörcsög petefészek (humán inzulin, növekedési hormon), kínai hörcsög petefészek és kölyök hörcsög vese sejtvonalakat használnak

és kölyök hörcsög vese sejtvonalakat használnak

▪ ▪ monoklonális ellenanyag termeltetésére (hybridoma technika: monoklonális ellenanyag termeltetésére (hybridoma technika:

ellenanyagot termelő limfocita és tumorsejt fúziójával létrehozott ellenanyagot termelő limfocita és tumorsejt fúziójával létrehozott

sejt) sejt)

▪ ▪ Az állati szövetek tenyésztésével feltárhatók az állati sejtekre Az állati szövetek tenyésztésével feltárhatók az állati sejtekre jellemző biokémiai utak és a sejtszintű szabályozás

jellemző biokémiai utak és a sejtszintű szabályozás

Állati sejtek és a bioreaktor technológia Állati sejtek és a bioreaktor technológia

▪ ▪

az állati sejt tenyésztés alapvetően különbözik a mikrobiális az állati sejt tenyésztés alapvetően különbözik a mikrobiális fermentációtól: az állati sejtek törékenyek (nem rendelkeznek fermentációtól: az állati sejtek törékenyek (nem rendelkeznek sejtfallal), nagyobb méret

sejtfallal), nagyobb méret

▪ ▪ az első lépes a megfelelő állati sejtvonalak kiválasztása az első lépes a megfelelő állati sejtvonalak kiválasztása (önállóan osztódni képes: kötőszövet, hámsejtek,

(önállóan osztódni képes: kötőszövet, hámsejtek, immunsejtek, tumorsejtek, idegsejtek)

immunsejtek, tumorsejtek, idegsejtek)

▪ ▪ a sejtvonalak életfeltételeinek meghatározása (növekedési a sejtvonalak életfeltételeinek meghatározása (növekedési forma: szabadon a szuszpenzióban vagy hordozóhoz kötve, forma: szabadon a szuszpenzióban vagy hordozóhoz kötve, kinetika, termékstabilitás, érzékenység mechanikai hatásokra, kinetika, termékstabilitás, érzékenység mechanikai hatásokra, oxigénigény)

oxigénigény)

▪ ▪ a tradicionális fermentációs ipar tapasztalataira támaszkodnak: a tradicionális fermentációs ipar tapasztalataira támaszkodnak:

megbízható, jól leírt, a méretnövelés megoldott megbízható, jól leírt, a méretnövelés megoldott

Levegőztetés Levegőztetés

▪ ▪ OO₂₂ igény kisebb (századrésze a mikroba fermentációéhoz képest) igény kisebb (századrésze a mikroba fermentációéhoz képest)

▪ ▪ méretnövelésnél azonban korlátozó tényező lehet az Oméretnövelésnél azonban korlátozó tényező lehet az O_{2 2} ellátásellátás

▪ ▪ a levegőztetésnél figyelembe kell venni bizonyos sejtek a levegőztetésnél figyelembe kell venni bizonyos sejtek nyírásérzékenységét

nyírásérzékenységét

▪ ▪ levegőztetési módszerek:levegőztetési módszerek:

• • felületi levegőztetés (önmagában nem elegendő)felületi levegőztetés (önmagában nem elegendő)

• • levegő átbuborékoltatása (nagyon hatásos, de károsíthatja a levegő átbuborékoltatása (nagyon hatásos, de károsíthatja a sejteket), néha tiszta O

sejteket), néha tiszta O₂₂-t használnak-t használnak

• • membrándiffúzió Omembrándiffúzió O→→ 2 ₂ –diffúzió egy szilikoncsövön keresztül–diffúzió egy szilikoncsövön keresztül

Habképződés Habképződés

▪▪a habképződés különösen nagy problémát jelent az állati a habképződés különösen nagy problémát jelent az állati

szérumot is tartalmazó tápközegek esetében, ha ezek a sejtek szérumot is tartalmazó tápközegek esetében, ha ezek a sejtek érintkeznek a habbal, valószínűleg elpusztulnak ( a hab

érintkeznek a habbal, valószínűleg elpusztulnak ( a hab károsíthatja a fehérjetermékeket is)

károsíthatja a fehérjetermékeket is)

▪ ▪ habzásgátlók: nem alkalmazzák (nem bizonyított az állati habzásgátlók: nem alkalmazzák (nem bizonyított az állati sejttenyészetek esetében a hatékonyságuk)

sejttenyészetek esetében a hatékonyságuk)

▪ ▪ nem ionos felületaktív anyag (PLURONIC®nem ionos felületaktív anyag (PLURONIC® F68): F68):

elterjedten alkalmazzákelterjedten alkalmazzák

pH-kontroll pH-kontroll

▪ a pH a sejtek jólétének egyik legfontosabb paramétere▪ a pH a sejtek jólétének egyik legfontosabb paramétere

▪ ▪ pH=6.5-9pH=6.5-9

▪ ▪ a legelterjedtebb pufferrendszer: bikarbonát-COa legelterjedtebb pufferrendszer: bikarbonát-CO₂₂

▪ ▪ pH csökkentése: steril COpH csökkentése: steril CO₂₂ befúvása (közvetlenül a tápközegbe, befúvása (közvetlenül a tápközegbe, nyírásérzékeny sejtek esetén a reaktor fejébe nyomják és

nyírásérzékeny sejtek esetén a reaktor fejébe nyomják és onnan diffundál a táptalajba)

onnan diffundál a táptalajba)

▪ pH növelése: Na-bikarbonát vagy Na-hidroxid hozzáadása▪ pH növelése: Na-bikarbonát vagy Na-hidroxid hozzáadása

▪ ▪ nagy méretekben könnyebben szabályozhatónagy méretekben könnyebben szabályozható

▪ ▪ a pH szabályozás általában automatizálta pH szabályozás általában automatizált

Hőmérséklet Hőmérséklet

▪ szűk határok között kell tartanunk (aranyhörcsög sejtek ▪ szűk határok között kell tartanunk (aranyhörcsög sejtek esetében 37°C)

esetében 37°C)

▪ ▪ hőmérséklet-ingadozás: maximum hőmérséklet-ingadozás: maximum ±±0,5°C (de az automatikus 0,5°C (de az automatikus hőmérséklet-szabályozók ennél precízebben tudják tartani a hőmérséklet-szabályozók ennél precízebben tudják tartani a

szükséges hőmérsékletet) szükséges hőmérsékletet)

▪ az alacsonyabb hőmérsékletet elviselik az állati sejtek▪ az alacsonyabb hőmérsékletet elviselik az állati sejtek

▪ ▪ de a magasabb hőmérséklet sejtkárosodáshoz, vagy a sejtek de a magasabb hőmérséklet sejtkárosodáshoz, vagy a sejtek pusztulásához vezet

pusztulásához vezet

Sterilizálás Sterilizálás

▪ az állati sejtek tenyésztésekor a lassú szaporodás miatt nagyon ▪ az állati sejtek tenyésztésekor a lassú szaporodás miatt nagyon fontos a sterilitás, mivel a mikroorganizmusok és vírusok gyors fontos a sterilitás, mivel a mikroorganizmusok és vírusok gyors

szaporodási képességük miatt, igen hamar túlnövik a szaporodási képességük miatt, igen hamar túlnövik a

tenyészetet tenyészetet

▪ a sterilizálás legfontosabb lépése: megelőző kezelések, ▪ a sterilizálás legfontosabb lépése: megelőző kezelések, intézkedések (szelepek, zaróelemek ellenőrzése)

intézkedések (szelepek, zaróelemek ellenőrzése)

▪ ▪ de a készülék üzembehelyezését megelőzi egy nyomás de a készülék üzembehelyezését megelőzi egy nyomás ellenőrzés gőzzel (gyakorlatilag sterilizálás is)

ellenőrzés gőzzel (gyakorlatilag sterilizálás is)

▪ a helyes sterilizálás minden kiegészítő eszközre kiterjed▪ a helyes sterilizálás minden kiegészítő eszközre kiterjed

▪ ▪ karbantartáskarbantartás

▪ ▪ a táptalaj hővel nem sterilezhető, ezért a fertőzések elkerülése a táptalaj hővel nem sterilezhető, ezért a fertőzések elkerülése érdekében a táptalajba antibiotikumot tesznek

érdekében a táptalajba antibiotikumot tesznek

Víz és gőz előállítása Víz és gőz előállítása

▪ a legegyszerűbb, de legkritikusabb alkotó ▪ a legegyszerűbb, de legkritikusabb alkotó

▪ ▪ bakteriális endotoxinok forrásabakteriális endotoxinok forrása

▪ ▪ standard víztisztító rendszerek: szénszűrő, ioncserestandard víztisztító rendszerek: szénszűrő, ioncsere

▪ ▪ RO vagy desztilláció?RO vagy desztilláció?

▪ ▪ a vizet használják tápközeg előállításához, az eszközök a vizet használják tápközeg előállításához, az eszközök

öbítéséhez, a gőzt sterilizáláshoz megfelelő tisztaságú vízre → öbítéséhez, a gőzt sterilizáláshoz megfelelő tisztaságú vízre →

van szükség van szükség

▪ WFI (Water For Injection) minőségű víz ▪ WFI (Water For Injection) minőségű víz

▪ minőségi kontroll (folyamatos, „menetrendszerű” ellenőrzés a ▪ minőségi kontroll (folyamatos, „menetrendszerű” ellenőrzés a szúrópróbaszerűvel szemben; mikrobiális szennyezés,

szúrópróbaszerűvel szemben; mikrobiális szennyezés, vezetőképesség, pH ellenőrzések, kémiai próbák)

vezetőképesség, pH ellenőrzések, kémiai próbák)

Tápközeg készítés Tápközeg készítés

▪ ▪ természetes közeget kell reprodukálni a tenyésztés során természetes közeget kell reprodukálni a tenyésztés során →→

komplex összetétel komplex összetétel

▪ ▪ vérszérum (tartalmazza a komplex növekedést serkentő és vérszérum (tartalmazza a komplex növekedést serkentő és gátló faktorokat, transzport fehérjéket) nélkül a legtöbb gátló faktorokat, transzport fehérjéket) nélkül a legtöbb

sejtvonal elpusztul, de veszélyforrás: vírusfertőzés sejtvonal elpusztul, de veszélyforrás: vírusfertőzés

▪ ▪ szérummentes táptalaj előnyei: olcsó, állandó összetétel, kisebb szérummentes táptalaj előnyei: olcsó, állandó összetétel, kisebb a fertőzés-beviteli rizikó

a fertőzés-beviteli rizikó

▪ alkotók: figyelni kell a sterilitásra▪ alkotók: figyelni kell a sterilitásra

jó minőségű víz, aminosavak (glükóz-glutaminsav), jó minőségű víz, aminosavak (glükóz-glutaminsav), lipidforrások (egyenes láncú zsírsavak, koleszterin), lipidforrások (egyenes láncú zsírsavak, koleszterin),

antibiotikumok, szervetlen sók (ionösszetétel, antibiotikumok, szervetlen sók (ionösszetétel,

ozmózisnyomás), bikarbonát-CO

ozmózisnyomás), bikarbonát-CO_{2 2} puffer rendszer, koenzimekpuffer rendszer, koenzimek

▪ Center of Biologics Evaluation and Research (CBER)▪ Center of Biologics Evaluation and Research (CBER)

▪ ▪ többek között ezeket szabályozzák:többek között ezeket szabályozzák:

•

• engedélyezett termék gyártásával kapcsolatos engedélyezett termék gyártásával kapcsolatos irányelvek

irányelvek •

• sejtvonalaksejtvonalak •

• tesztek, melyek garantálják a szennyezésektől tesztek, melyek garantálják a szennyezésektől mentes biológiai termékeket

mentes biológiai termékeket

▪ ▪ ha valaki gyártani és értékesíteni akar egy terméket, akkor ha valaki gyártani és értékesíteni akar egy terméket, akkor annak gyártási technológiáját a CBER-nek jóvá kell hagynia annak gyártási technológiáját a CBER-nek jóvá kell hagynia

Állati sejtek fermentációjával előállított Állati sejtek fermentációjával előállított

termékek kibocsátásának szabályozása

termékek kibocsátásának szabályozása

A jövő A jövő

▪ gyógyszeripari biotechnológiában a „jövő”:▪ gyógyszeripari biotechnológiában a „jövő”:

az állati sejtvonalak kiválóan alkalmazhatók a különböző az állati sejtvonalak kiválóan alkalmazhatók a különböző rákellenes szerek, illetve gyógyszerek

rákellenes szerek, illetve gyógyszerek

hatásmechanizmusának vizsgálatára (állatkísérletek hatásmechanizmusának vizsgálatára (állatkísérletek

kiegészítése, részleges helyettesítése)kiegészítése, részleges helyettesítése)

Köszönöm a figyelmet! Köszönöm a figyelmet!