2020. május 4.

11. óra

Állati (és emberi) sejtek tenyésztése

2020. május 4.

2

Bevezetés

•Az élőlények hierarchikus szerveződése:

• Sejt → Szövet → Szerv → Szervrendszer

•Egyedfejlődés:

• embrionális őssejt → differenciálódott sejtek

Figyelemre méltó, hogy a mutációktól eltekintve egy többsejtű élőlény minden egyes testi sejtje ugyanazt a genetikai információt hordozza, csak a génállományának más-más részei aktívak.

3

Történeti áttekintés

1830 Schleiden-Schwann: kidolgozták a sejtelméletet, mi- szerint minden élőlény sejtekből áll

1855 Wirchow: minden sejt sejtből lesz (omnis cellula e cellu- la)

1885 Roux embrionális (madár) sejtek in vitro fenntartása 1967 Van Wezel: a mikrokarrieres sejttenyésztés

1970 rekombináns DNS technika alkalmazása állati sejteknél 1975 Köhler-Milstein: hibridóma sejt előállítása és mono-

klonális antitestek (immunfehérjék) termelése

4

A tenyésztés alapjai

• Sejttenyésztés: egymástól elválasztott (diszpergált) sejtek fenntartása “kémcsőben” = in vitro körülmények között.

•Szövettenyésztés: a szövet fenntartását jelenti oly

módon, mely lehetővé teszi a sejtek differenciálódását

ill. a szövetre jellemző szerkezet (struktúra) és/vagy

funkció megőrzését.

5

Állati sejt/szövettenyésztés

•Egészen más, mint a mikroorganizmusok tenyésztése. Miért?

•Mert a mikróba sejtek nincsenek alárendelve egy felsőbb irányító rendszernek, amit szervezetnek hívnak. “Egyéni vállalkozók”, szemben a többsejtű élőlények sejtjeivel, amik “egy multinak dolgoznak”. Ebből következően a többsejtű élőlények sejtjei a szervezet szabályozásától nem függetlenek. Létezésükhöz, növekedésükhöz,

szaporodásukhoz szükségük van a szervezet többi sejtjével való kommunikációra (információ cserére).

•Ennek egyik következménye, hogy az egészséges állati sejtek nem osztódnak korlátlanul* akkor sem, ha elegendő tápanyag áll rendelkezésükre. Az osztódási hajlandóságuk függ attól, hogy a környezetükből milyen jelzések érkeznek hozzájuk.

Közvetlen környezetüket a szomszédos sejtek, tágabb környezetüket a szervezet távolabbi részei jelentik, melyekkel a szövetközötti folyadék (szövetnedv és/vagy vér) útján kommunikálnak.

•Mi következik ebből a fenntartásukra nézve?

•* Emlékeztető: a prokarióták önmagába visszazáródó, ún. cirkuláris DNS-sel

rendelkeznek, az eukariótáké viszont lineáris, tehát van “eleje” és “vége”.  az

eukarióta DNS minden osztódáskor kicsit rövidül, ha nincs olyan mechanizmus a

sejtben (telomeráz enzimek), ami ellensúlyozhatná ezt.

6

A sejtvonalak egy része csak felülethez kötve növekszik (monolayer, kontakt gátlás) → speciális tenyésztő edények.

A növekedéshez nem elég a tápoldatba keverni minden számukra szükséges táptalaj komponenst, hanem olyan anyagokat is kapniuk kell, amik növekedési és osztódási jelként vagy utasításként szolgálnak számukra.

Előfordul azonban, hogy egy sejt vagy sejtcsoport a szervezetben betöltendő szerepéhez képest nagyobb önállóságra tesz szert. Ezek a rákos sejtek. Az állati sejttenyésztés során többnyire rákos sejtvonalakat használnak.

Van néhány, ami szuszpenzióban is szaporodik (CHO, BHK, VeRo, HeLa), mint a mikrobák → fermentorszerű készülékek.

Milyen élőlények sejtjeit szokták tenyészteni?

Általában emlős sejteket tenyésztenek, de előfordul madár és rovar sejtek tenyésztése is.

Miben más az állati sejtek tenyésztése a mikróbák tenyésztésétől?

7

Mi értelme van állati sejteket tenyészteni?

• kutatás: az állati sejtekre jellemző biokémiai utak, különböző sejtszintű szabályozások

• állatkísérletek kiegészítése, részleges helyettesítése

• rekombináns fehérjék előállítása (pl. interferonok, növekedési hormonok, stb.).

Egyes glikozilált fehérjéket csak állati sejttenyésztéssel lehet előállítani, mert a prokarióta vagy egysejtű eukarióta sejtek nem tudják a rájuk jellemző glikozilációs mintázatot előállítani.

• A glikoziláció szén-hidrát (“cukor”) egységek hozzákapcsolását jelenti a fehérjékhez.

Nem minden fehérjére jellemző. A fehérje szerkezet stabilizálásában, a fehérjék más molekulákkal való kölcsönhatásainak elősegítésében, a saját és idegen eredetű

fehérjék megkülönböztetésében lehet szerepe. Prokarióták is képesek lehetnek rá, de az általuk a fehérjékhez kapcsolt szén-hidrát egységek más szerkezetűek, mint amit az emberi szervezet elő tud állítani. Részben ez a különbség játszik szerepet abban, hogy a veleszületett immunrendszer képes gyorsan felismerni a kórokozókra jellemző

sejtfelszíni molekula mintázatokat, és ezáltal egy fertőzésre gyorsan reagálni.

• monoklonális ellenanyagok (immunfehérjék) termeltetése (hibridóma sejtekkel)

• vírusok szaporítására vakcinagyártás céljából

8

A fenntartás korlátja

•A gerincesek legtöbb sejtje csak korlátozott számban osz- tódik az izolálást követően, azaz a tenyészet elöregszik (=

szeneszcencia)

•Okai:

1. a kromoszómavégek (telomérák) minden osztódási ciklusban bekövetkező megrövidülése

2. aktiválódnak a sejtciklust ellenőrző (és azt leállító) me- chanizmusok

• Csak a tumorsejtek osztódnak korlátlanul (immortality).

Kutatásban gyakran használt daganatos emberi és állati sejtvonalak

 “Halhatatlanná tett” vagy immortalizált sejtvonalaknak is nevezik őket, mert nem működnek bennük a sejtosztódást gátló, sejten belüli vagy kívülről érkező

mechanizmusok.

CHO = Chinese hamster ovary, kinai horcsog petefeszek sejtvonal.

BHK = Baby hamster kidney, embrionalis horcsog vese sejtvonal VeRo = majom veseszovet

HeLa = Szemelynevből, egy Henrietta Lacks nevű holgynek allit emleket, akinek a nőgyogyaszati tumorabol izolaltak ezt a sejtvonalat.

 A legelsőként izolált és leggyakrabban használt immortalizált emberi sejtvonal

 1951-ben izolálták Ms. Henrietta Lacks szövetmintájából.

 1953-ban már a poliomyelitis (gyermekbénulás) vírus elleni vakcina laboratóriumi teszteléséhez használták a sejtvonalat.

11

Tenyészetek növekedése

 Balra egy letapadó sejttenyészet mikroszkópos képe, jobbra egy lebegő, ún. szuszpenziós tenyészet mikroszkópos képe látható.

 A tápoldatban való lebegés nem jellemző az állati sejtekre, ezt rákos sejtvonalakkal dolgozva lehet csak elérni. Kivétel: a vér sejtes elemei, így a fehérvérsejtek (az immunrendszer sejtes elemei).

 A lebegő sejtek teljes felületükkel érintkeznek a tápoldattal, így nagyobb felületen keresztül zajlik az anyacsere a sejt és a környezet között.

12

Milyen típusú sejteket lehet szaporítani?

•Szinte minden szövet szaporítható, az izom és ideg kevésbé. Az érett vérsejtek nem osztódnak.

•Fibroblaszt (kötőszövet): generációs ideje kicsi, felületeken gyorsan nő, túlnövi az egyéb szöveteket

•Epitheliális (hám) sejtek: sok specializálódott sejt van

•A korai embrionális eredetű sejtek jól szaporodnak

•Rágcsálók (pl. egér, patkány, hörcsög) sejtjei is

•FONTOS: nem csak rákos állati sejtvonalak tenyésztésével foglalkoznak, egészséges

sejtkultúrákat is lehet szaporítani. Csak ebben az esetben a korlátozott számú

osztódás határt fog szabni a felhasználás időtartamának.

13

Hogyan lehet egy állati szövetmintából állati sejttenyészetet készíteni?

1. A sejttenyésztéshez szükséges oldatok elkészítése.

2. A tenyésztés céljára felhasználandó szövet előkészíté-se.

3. Enzimes sejtdisszociáció: kollagenáz, tripszin és egyéb proteáz enzimek alkalmazásával

4. A sejtszuszpenzió szűrése a sikeresen diszpergált sejtek és a megmaradt szövetdarabok szétválasztására.

5. A sejtek centrifugálása

6. A sejtüledék reszuszpendálása, friss tápfolyadékban.

14

15

• Ha elérték a megfelelő sejtsűrűséget, a tenyészetből szub- kultúrákat készítenek, ezek egy részét tárolásra/deponálás-ra előkészítik (  eltartás ld. később), illetve közvetlenül to- vábbtenyésztésre, manipulációra vagy termelésre használ-ják fel.

• Szubkultúra: egy genetikailag homogén tenyészetet több résztenyészetre osztanak, amelyeknek további felhaszná-lása eltérő lehet (pl. konzerválják, termelésre használják, stb).

Szubkultúra készítése a véges számú osztódás korlátainak

ellensúlyozására

16

Sejtvonalak eltartása

•Egy sejtvonal átlagosan 100 átoltás után elöregszik, szapo- rodó képessége csökken, majd a szaporodás leáll.

•Ezért „gazdálkodni” kell a szaporítási ciklusokkal.

•Célszerű a preparálás után kevés átoltással számos szub- kultúrát készíteni, és ezek nagy részét tartósítani. Ez az ún.

„Master cell bank”, amihez vissza lehet nyúlni, ha a hasz- nálatban lévő tenyészetek elöregedtek, vagy befertőződ-tek.

•Az egyes munkahelyeken (labor, üzem) is létrehoznak tar- tósan tárolt szubkultúrákat a kapott sejtvonalakból, amihez vissza lehet nyúlni a szaporodó tenyészetek elvesztése esetén („working cell bank”).

•Célszerű a tenyészeteket és az átoltásokat törzskönyv-sze-

rűen nyilvántartani.

17

Az állati sejttenyésztés tápoldatai “1”

• Tápoldatok: reprodukálni kell a természetes környezetet:  vér, sejtközti folyadék (sokkomponensű, drága).

• A normál sejteket vér veszi körül, illetve a sejtközötti folyadék. Ez nagyon sok komponensből áll, ezeket mind bele kell mérni a tápoldatba. Míg a mikróbáknál elegendő volt a cukor, a szójadara és néhány műtrágya, az állati sejteknél sokféle, tiszta és drága anyagra van szükség:

• Szénforrás: glükóz (mint a vércukor), glutamin!  ener-gia és N-forrás.

• 15 - 20 féle aminosav,

• vitaminok,

• koenzimek,

• lipidek,

• ásványi ionok (pontos összetétel, ozmózis nyomás)

18

Módosított Eagle médium (MEM)

19

Az állati sejttenyésztés tápoldatai “2”

•(VÉR)SZÉRUM: a sejtvonalak nagy része igényli a vérfehérjék jelenlétét is, enélkül a legtöbb sejtvonal elpusztul.

•Ezt újszülött állatok (borjú, csikó) vérszérumával biztosítják (5-15%). Ez nagyon drága (és nehezen reprodukálható), ezért törekszenek a minimalizálására, helyettesítésére vagy teljes elhagyására.

•Kompex rendszer, az albumin mellett sok szabályozó, serkentő és gátló faktort tartalmaz.

• Kitekintés: miért kell ehhez újszülött állat, amikor egy kifejlett marhában sokkal több a vér?

• Mert tisztább a vérszéruma. A felnőtt vérébe bele van írva az egész kórtörténete. Benne van az átélt összes fertőző betegség immunfehérjéje, az összes kapott vedőoltás által létrehozott immunfehérjék, valamint a lappango vírusok es vírusfehérjék. Az újszülött állat vérében ezek még nem jelentek meg.

• A szerum komponens nagyon draga (es nehezen reprodukalhato, hiszen nincs ket egyforma allat, meg testverek eseteben sincs tokeletes azonossag). A kutatok sok erőfeszitest tesznek a szerummentes tapoldatok kifejlesztesere, vannak is eredmenyek, de termelesi meretben

keves technologiat valositottak meg szerummentes tapoldattal. A szerum koltsege meg a laboratoriumi kiserleteket is nagyon megdragitja. A verszerumok legfőbb komponense az albumin (kb. 2/3), mellette meg legalabb 40 feherjejet lehet meg kulonboztetni, es

mindegyiknek van valamilyen funkcioja a sejtek műkodeseben (pl. ragasztó fehérjék, hormonok  inzulin).

20

Az állati sejttenyészetés körülményei

•A sejtek nagyon érzékenyek pl. a nyíróerőkre, mivel csak sejtembrán határolja őket, de

nincsen sejtfaluk:

•

nagyon kíméletes keverés,

•

a levegőztetésnél sem lehetnek buborékok

•

Az ozmózis nyomás kiegyenlítsére is figyelni kell, hasonlóan a protoplasztok tenyésztéséhez.

•Hőmérséklet: emlős sejteknél 37°C, madársejteknél 41°C, rovarsejteknél 25-30 °C

• Szerencsere az oxigén igényük eleg kicsi, korulbelul szazszor kisebb, mint egy hasonlo mikroba tenyeszete.

• Emiatt nem kell atbuborekoltatni a folyadekon a betaplalt levegőt, hanem elegendő a folyadekfelszin felett ataramoltatni a steril levegőt.

• A kis oxigen-igeny lassu anyagcseret jelez, lassabban szaporodnak, es lassabban hasznaljak fel a cukrot is.

• Némelyik sejtvonal igenyli a szendioxid jelenletet is a légtérben (2-5%). Ennek

magyarazata az, hogy a szervezetben azok a sejtek, amelyek tavol vannak a gyors es intenziv gazcseretől, alacsony oxigentartalom es magas szendioxid tartalom

jelenleteben műkodnek, azaz termeszetes kornyezetukben is magas a szendioxid

szint.

21

Laboratóriumi tenyésztő edények (felületi)

Az abran lathato, hogy itt is hasznalnak Petri cseszeket. A kepen lathato

elrendezes sok (6, 12, 24, 48, 96) kis Petri csesze egyuttesenek foghato fel, ezeket talcanak nevezik. A tálcák sorozatvizsgálatokra különosen alkalmasak.

22

Laboratóriumi tenyésztő edények (felületi)

Az ábrán lathato tenyesztőedenyek also sima reszet hasznaljak szaporitasra, tehat a

tapoldatot beoltjak a sejtekkel, melyek letapadnak a feluletre es monolayerrel boritjak be az edeny also falat. A sejt reteg annyira vekony, hogy atlatszo, szabad szemmel alig latszik. Ha egy kicsit megmozgatjak az edenyt, akkor lehet nemi opalizalast lehet latni a feluleten. Az edeny nyaka nem szimmetrikusan, kozepen helyezkedik el, hanem folfele eltolva. A magasabban levő nyak miatt a folyadek nehezebben lottyenhet ki. Az edenyek kulonboző meretben, sterilezve kaphatok, anyaguk műanyag, altalaban egyszeri hasznalat utan eldobhatok. Uveg edenyeket nem szoktak hasznalni, mert az uveg anyagabol kalium es natrium ionok oldodnak ki, es ezek a sejtek erzekenyek az alkali femionokra.

23

Laboratóriumi tenyésztő edények (felületi)

A taptalaj szine azert piros, mert adnak hozza egy indikatort, melynek az a tulajdonsaga, hogy a pH valtozasara megvaltoztatja a szinet. Ezzel az esetleges fertőzeseket lehet kimutatni.

Normalis novekedesnel a kozeg semleges marad, az indikator megtartja piros szinet. Ha a viszont a tenyeszet befertőződik, mert mikroba kerul bele, akkor az megsavanyitja a folyadekot,

amitől az indikator sarga szinű lesz. Igy ranezesre eszre lehet venni a mikrobialis fertőzeseket.

24

Felület növelése

Multitray roller bottles

A forgó edények “szakaszos kenést”

biztosítanak a belső falukra tapadó sejtkultúra számára.

Nagyobb leptekű szaporitasnal minel nagyobb benőhető feluletre van szukseg a keszulekekben.

Erre tobbfele szellemes megoldast is kitalaltak.

25

Mikrokarrieres tenyésztés a sejtek rendelkezésére álló letapadási felület további növelésére

Inokulálási/tapadási fázis kialakult monolayer

26

Mikrokarrieres tenyésztés

• van Wezel 1967: DEAE Sephadex A50-en

• Apró, szuszpendált gyöngyök felületén,

• átmérő: 100-300 m,

• sűrűség: 1,02-1,05 g/cm

(lebegésben tartható),

•A fermentor térfogatának 8-15%-a hordozó,

•felülete 0,5-1,5 m

/l, ami 10-30 forgó palacknak felel meg, = nagy produktivitás

• Előnyei:

 nagy felületet be lehet bevinni egy adott reaktor-térfogatba

 viszonylag homogén környezet

 nincs szükség új reaktortípusokra

27

Lépések:

Inokulum vagy “oltó tenyészet” készítése az első lépése: forgó palackból a tenyészetet tripszin enzimmel leoldják.

A sejtek megtapadnak a gyöngy felületén, átlagosan 5-6 sejt egy gyöngyön, elszaporodnak, egy rétegben nőnek

(monolayer, kontakt gátlás),

függ: sejtvonaltól, mikrokarrierek jellemzőitől, a sejt

növekedési fázisától, a médium összetételétől és a sejt/

mikrokarrier számaránytól

Mikrokarrieres tenyésztés

28

Keverés: az immobilizált sejtek érzékenyebbek a nyíróerőkre, lekerekített keverők, nagy keverő átmérő, kis fordulatszám szükséges.

Levegőztetés: direkt levegőztetésnél a felszálló és szétpukkanó buborékok károsíthatják a sejteket, ezért a felső légtérben vagy indirekt módon.

A gyöngyök könnyen leülepednek, fölötte a tápoldat lecserélhető, illetve könnyű feldolgozni.

A gyöngyöket nem lehet/érdemes újra felhasználni.

Mikrokarrieres tenyésztés

29

„Spinner flask”

Mágneses keverő, lassú mozgatás

Mikrokarrieres és szuszpenziós tenyésztésre egyaránt

30

Kevert reaktorok

Általánosan szuszpenziós tenyésztéshez, de mikrokarrie-rekkel felületi tenyészetekhez is használható.

Energiabevitel kisebb, kevesebb O

kell, így kevésbé káro-sodik a sejt, néha elegendő a felületi levegőztetés, a cél csak a homogenizálás és szuszpenzióban tartani a sejte-ket/mikrokarriereket

perfúziós levegőztetés: valamilyen elválasztón keresztül (acélszita, szilikon cső), nincs károsodás

Keverő: lekerekített formák, hajócsavar, 25-250 rpm

• Sejtszaporítási technikák csoportosítása a tápanyag bevitel alapján

31

Szakaszos tenyesztes: (batch): a folyamat legelejen az osszes tapanyagot bemerik

tapfolyadekba, beviszik az oltotenyeszetet, elindul a szaporodas, termekkepzes, majd a vegen megtortenik a feldolgozas. Menet kozben tovabbi tapanyagot nem adnak hozza. Gyenge

produktivitas, a sejtkoncetracio ~106 sejt/ml. Időtartama ~1 het.

Rataplalasos-szakaszos (fed-batch): a szakaszoshoz hasonloan indul, de menetkozben tobbszor is potoljuk az elfogyasztott tapanyagokat. Altalaban glukozt es aminosavakat adnak hozza. A tobbszori rataplalas miatt akar 3 hetig is fenntarthato a folyamat, es ennek megfelelően a produktivitas is nagyobb.

Felfolytonos tenyesztes (perfuzios): Itt folytonos vagy kvazi-folytonos tapanyag betaplalast alkalmaznak es ugyanakkor a termeket tartalmazo fermentleből is elvesznek. Mivel a

mikrokarrierek konnyen ulepednek a keveres kikapcsolasa utan, folulről a fermentle leszivhato, egyszerű elvalasztani, es belőle a termeket kinyerni. A hordozon levő sejtekre ujra friss

tapoldatot toltenek. A sejtszam egy idő utan mar nem novekszik, hiszen a monolayer mar

kialakult, de az elerhető sejtszam egy nagysagrenddel is nagyobb lehet, elerheti a 107 sejt/ml-t is. Ha nagyobb a sejtsűrűseg, akkor nagyobb a megtermelt anyag (feherje) mennyisege is.

Napi lefejtessel es rataplalassal akar 6 hétig is fenntarthato egy termelesi folyamat.

Osszessegeben a termek is koncentraltabb, es a szukseges reaktorterfogat a szakaszosnak csak 1%-a.