Aminosavak tisztításának és elválasztásának vizsgálata szimulált mozgóréteges preparatív
folyadékkromatográfiás művelettel
Doktori (PhD) értekezés
Készítette: Molnár Zoltán
Témavezetők: Dr. Szánya Tibor egyetemi docens Dr. Hanák László egyetemi docens
Pannon Egyetem Vegyipari Műveleti Tanszék
Veszprém, 2009.
Aminosavak tisztításának és elválasztásának vizsgálata szimulált mozgóréteges preparatív
folyadékkromatográfiás művelettel
Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta:
Molnár Zoltán
Készült a Pannon Egyetem Vegyészmérnöki Doktori Iskolája keretében Témavezetők: Dr. Szánya Tibor, egyetemi docens
Dr. Hanák László, egyetemi docens Elfogadásra javaslom (igen / nem)
………..
(aláírás) Elfogadásra javaslom (igen / nem)
………..
(aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton …... % -ot ért el,
Veszprém, ………..
a Szigorlati Bizottság elnöke Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom:
Bíráló neve: …... …... igen /nem
………..
(aláírás) Bíráló neve: …... …... igen /nem
………..
(aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …...% - ot ért el
Veszprém, ……….
a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése…...
……….
az EDT elnöke
Tartalomjegyzék
Kivonat iii
Abstract iv
Auszug v
Köszönetnyilvánítás vi
1. Bevezetés 1
2. Elméleti rész 3
2.1 Aminosavak 3
2.1.1 Fizikai-kémiai tulajdonságok 3
2.1.2 Az aminosavak előfordulása, aminosav források 7
2.1.3 Az aminosavak felhasználása 8
2.1.4 Aminosavak ipari előállításának lehetőségei 9
2.1.5 Aminosavak szorpciós tulajdonságai 10
2.2 A folyadékkromatográfia elméleti áttekintése 15
2.2.1 Történeti áttekintés 15
2.2.2 A kromatográfia alapfogalmai 15
2.2.3 Folyamatos preparatív folyadékkromatográfiás műveletek 22 2.3 A preparatív folyadékkromatográfia és az SMB gyakorlata 36
2.3.1 A szimulált mozgóágy létrehozása 36
2.3.2 Az SMB alkalmazási területei 41
2.3.3 Polimer adszorbens gyanták jellemzői 44
3. Matematikai modell 47
3.1 Matematikai modellezés lehetőségei 47
3.2 Az aminosav elválasztás matematikai modelljének megalkotása 50
4. Kísérleti rész 55
4.1 Célkitűzés 55
4.2 Fenilalanin vizes oldatának sómentesítése 62
4.2.1 Feladatmeghatározás 62
4.2.2 A sómentesítési kísérletekhez felhasznált eszközök és anyagok 63
4.2.3 Fenilalanin sómentesítési kísérletek 68
4.3 Fenilalanin-glicin aminosav elválasztás vizsgálata 84
4.3.1 Feladatmeghatározás 84
4.3.2 A fenilalanin-glicin elválasztáshoz felhasznált eszközök és anyagok 84 4.3.3 Fenilalanin – glicin SMB szeparációs kísérletek 91 4.4 Fenilalanin-glicin aminosav elválasztás sógradienssel 111
4.4.1 Feladatmeghatározás 111
4.4.2 A fenilalanin-glicin sógradiens elválasztás eszközei és felhasznált anyagok 112 4.4.3 Fenilalanin – glicin sógradienses elválasztási kísérletek 114
5. Új kutatási eredmények 123
Theses 125
Irodalomjegyzék 127
Függelék 130
Kivonat
A szerző aminosavak elválasztását, és vizes aminosav oldatok sómentesítését vizsgálta polimer adszorbens gyanta tölteteken, szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfiás művelettel. Kísérleteit egy kislaboratóriumi méretű 6 oszlopos (belső átmérő 1,3 cm, oszlophossz 12,5 cm) és egy nagylaboratóriumi méretű 4 oszlopos (belső átmérő 5 cm, oszlophossz 50 cm) készüléken végezte. Az elválasztáshoz használt töltetek az Amberlite XAD-7, XAD1180, a DIAION HP20, HP2MG és a SEPABEADS SP825 polimer adszorbensek. Mindegyikre jellemző, hogy 0,3…0,5 mm szemcseméret tartományú gyöngypolimerek. Az adszorpciós egyensúlyok, a töltet jellemzők mérése után az SMB készülék geometriája ismeretében korábban elkészített matematikai modelleket fejlesztett tovább a szerző, amellyel a művelet paraméter optimálását és szimulációját végezte. Ez a munka az oszlopkonfiguráció, a hőmérséklet, az aminosav-koncentráció és az elektrolit koncentráció műveleti jellemzőkre gyakorolt hatásait kísérleti úton és számítógépi szimulációval vizsgálja. Minden esetben a termelékenység javítása a cél, előre meghatározott tisztaságra és kihozatalra vonatkozó követelmények figyelembevételével. A referencia paramétereket tekintve a hőmérséklet 60°C-ra történő emelésével 216%-os, az aminosav- koncentráció növelésével 360%-os, míg sógradiens alkalmazásával 200%-os termelékenység növekedés mérhető. A kísérletek során mért és a szimulációval számított adatok jól egyeznek.
Kulcsszavak: szimulált mozgóréteges kromatográfia, aminosav elválasztás, polimer adszorbens
Investigation of amino acid separation and purification by simulated moving bed chromatography
Abstract
The author has examined separation of amino acids, and desalination of aqueous amino acid solutions with simulating moving bed (SMB) chromatography.
His experiments were performed on a six-column small-laboratory-scale (I.D. = 13 mm, L = 125 mm) equipment and on a 4-column large-laboratory-scale (I.D. = 50 mm, L = 500mm) equipment. The packings used for the separation are the Amberlite XAD-7, XAD1180, the DIAION H20, HP2MG and the SEPABEADS SP825 polymeric adsorbents.
It is characteristic for all of them that they are polymer beads with particle diameter between 0,3-0,5 mm.
After the measurement of the adsorption equilibriums and the parameters of the packing by knowing the geometry of the SMB equipment, the author was improving previously made mathematical models, with which the parameter optimization and simulation of the operation were performed.
This work is examining the effects of the columns configuration, the temperature, the concentration of amino acids and electrolyte on operation parameters by experimenting and computer simulation. In every case the aim is increasing the productivity by considering the prescribed requirements concerning purity and yield.
An increase of productivity of 216% can be measured by raising the temperature to 60°C (taking into account the reference parameters), 360% by increasing the concentration of amino acids and 200% by using salt gradient. The measured and the calculated data agreed well.
Keywords: simulated moving bed chromatography, amino acid separation, polymeric adsorbent resin
Untersuchung zur Trennung und Purifikation Aminosäuren mit SMB-Prozessen
Auszug
In diesem Dissertation wurde die SMB (simulierter Gegenstrom) chromatographische Trennung den Aminosäuren in Wasser-Lösungen sowie die Salz-Entfernung von Aminosäuren in Wasser-Lösungen untersucht. Für die Separation wurde unterschiedliche Adsorptionspolymers gebraucht (Polymerperlen mit verschiedenen chemischen Aufbau, typischer Durchmesser zwischen 0,3 und 0,5 mm).
Die Versuche wurden einerseits mit einem 6-säuligen SMB (Trennsäulen innere Durchmesser 1,3 cm, Länge 12,5 cm), andererseits mit einem 4-säuligen SMB (Trennsäulen innere Durchmesser 5 cm, Länge 50 cm) durchgeführt. Beide Apparat wurde an der Pannon Universität Veszprém gebaut.
Für die Rechnung den optimalen Verfahrensparameter wurden zuerst die Messungen den Gleichgewichte und Säulen-charakteristik (NTP, Porosität) durchgeführt.
Die Verfahrensparameters am Anfang wurden mit dem linearen Morbidelli-Method kalkuliert, dann dieselbe in der Kentniss den Adsorptionsisothermen und NTP mit einem Simulationssoftware optimalisiert. An der Universität Veszprém ein früher geschriebene Simulationssoftware wurde vom Author weiter entwickelt, so wurde möglich auch die 6-säuligen System und SMB-Prozessen mit Salz- gradient zu modellieren.
In dieser Arbeit es handelt sich um den Einfluss verschiedene Parameters auf die Leistungskennzahlen, sowie die Temperatur den Säulen, der Konzentration den Aminosäuren und die Elektrolyten in der Trennungsmischung und der Konfiguration den SMB-Säulen. Mit dem optimierten SMB-Parameters wurden Versuche sowie auch Simulationen ausgeführt, die Ergebnisse übereinstimmen gut.
Schlüsselwörter: simulierte Gegenstromchromatographie (SMB), Trennung Aminosäuren, Polymer Adsorbenzien
Köszönetnyilvánítás
Köszönetemet ezúton szeretném kifejezni témavezetőimnek, Dr. Szánya Tibornak és Dr.
Hanák Lászlónak kísérleti munkámban, publikációimban és az értekezés megírásában nyújtott folyamatos segítségükért.
Itt szeretném megköszönni Dr. Szánya Tibor egyetemi docens úrnak és Prof. Dr. Andreas Seidel-Morgenstern professzor úrnak a meghívást a Max-Planck Intézetbe, ahol lehetőségem volt nagyon sokat tanulni az ott végzett folyadékkromatográfiás és csatolt technikákból végzett kutatásokból.
Köszönet Dr. Argyelán Jánosnak a szimulációs szoftver módosításában nyújtott segítségéért.
Köszönet illeti továbbá a Pannon Egyetem (korábban Veszprémi Egyetem) Vegyipari Műveleti Tanszékének vezetőjét, Dr. Horváth Gézát, és a Tanszék minden dolgozóját támogató munkájukért.
Köszönöm PhD-hallgató társamnak, Nagy Melinda Magdolnának - aki hasonló témakörben végzett kutatásokat, - hogy konzultáltunk a közös problémáinkról és sokszor együtt találtunk megoldást a kérdésekre.
Továbbá szeretném megköszönni a dolgozat befejezéséhez nyújtott nélkülözhetetlen segítséget a Veszprémi Egyetem végzett hallgatóinak, Keszte Barbarának és Madarász Józsefnek.
A kutatások pénzügyi támogatását ezúton szeretném megköszönni a Richter Gedeon Vegyészeti Gyár NyRt.-nek, illetve az NKFP-3A/0047/2002 Széchenyi Terv nemzeti kutatási és fejlesztési programjának, valamint a Veszprémi Egyetem Vegyészmérnöki Intézet Kooperációs Kutatási Központjának.
1. Bevezetés
Folyamatosan növekszik a biotechnológiai úton előállított hatóanyagok, segédanyagok száma. A biomolekulák gyártása a legújabb mikrobiológiai módszerekkel történik. Ezek az új módszerek több szempontból is előnyösek lehetnek a szerves vegyipari szintézisekkel szemben. A szintetikus eljárásokhoz általában katalizátor és szerves oldószer-igény társul. Királis molekulák szintézisekor katalizátor nélkül racém termék keletkezik, csak nagyon drága, speciális katalizátorral lehetséges optikailag tiszta anyagot előállítani. Biológiai úton, a megfelelő mikroorganizmus tenyészettel elérhető az optikailag tiszta termék, de megfelelő körülmények közt az élő sejt nélküli, enzimkatalitikus eljárások is működőképesek. A biotechnológiai folyamatokban melléktermékként keletkező iszapok is hasznosíthatók (talajerő, takarmány). A biotechnológia másik területe, amikor valamilyen természetes anyagot, pl. növényi cellulózt vagy állati vázfehérjéket dolgoznak fel hidrolízissel, és így nyernek értékes molekulákat. Cellulózból lehetőség van cukrok, alkoholok gyártására, míg vágóhídi szőr-, toll, illetve bőrgyári bőrhulladékból aminosavak előállítására. A hidrolízis savas vagy lúgos közegben vagy enzimatikus úton történhet. Ebben az esetben főként vizes fázisban keletkeznek a számunkra értékes komponensek. Mivel folyamatosan bővül az ilyen módon gyártott molekulák száma, egyre nagyobb szerepet kapnak az ehhez kapcsolódó elválasztási módszerek.
A fizikai feldolgozás (szűrés, centrifugálás) után az ioncsere vagy a fordított fázisú adszorpciós folyadékkromatográfia lehet a leghatékonyabb megoldás, ha a komponensek nem illékonyak, magasabb hőmérsékleten bomlanak, illetve, ha a fizikai tulajdonságaik (pl. forráspont) igen közeliek. A kromatográfiás eljárás termelékenysége növelhető, oldószer felhasználása mérsékelhető, ha folyamatos művelettel, pl. szimulált mozgóréteges kromatográfiával dolgozunk.
Értekezésem témája aminosavak szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfiás elválasztásának vizsgálata. A folyadékkromatográfiás elválasztási műveleteknek ez egy, az utóbbi években dinamikusan fejlődő ága.
A Veszprémi Egyetem (Pannon Egyetem) Vegyipari Műveleti Tanszéke az 1990-es évek végétől eredményes kutatásokat végez szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfiás műveletek területén. Ezen műveletek elsősorban a nehezen
szétválasztható és/vagy nagytisztaságú anyagok kinyerésére, tisztítására, izolálására alkalmazhatók előnyösen, különösen abban az esetben, ha kétkomponensű vagy kromatográfiás szempontból kétkomponensűnek tekinthető elegyek frakcionálása a feladat.
A téma előzményeihez tartozik továbbá a Tanszék korábbi kutatási területe, melynek során a Pécsi Bőrgyárral és a REANAL Finomvegyszergyárral közösen bőrgyári hulladékok hidrolízises feldolgozásával és aminosavak kinyerésével foglakoztak.
A dolgozat három fő egységből áll. Az első egységben áttekintést kaphatunk az aminosavakról, a polimer adszorbensekről, a preparatív kromatográfiáról és annak tervezési módszereiről, valamint a szimulált mozgóréteges elválasztási technikákról és alkalmazási területeiről. A második egységben a szimulált mozgóréteges művelet matematikai modelljét, annak alkalmazását és az aminosav elválasztással kapcsolatos kísérleteket mutatom be. A harmadik egységben a kutatási munka eredményei alapján megfogalmazott tézisek szerepelnek.
Reményeim szerint a megfogalmazott megfigyelések, tézisek hasznosak lesznek a kutatások folytatásához.
2. Elméleti rész 2.1 Aminosavak
A szimulált mozgóréteges preparatív elválasztási műveletek a biotechnológiában is egyre szélesebb körben terjednek, például cukrok, hormonok, fehérjék és aminosavak elválasztása területén. A Veszprémi Egyetem Vegyipari Műveleti Tanszéke régebb óta végez kutatásokat fehérjehulladékok hidrolízises feldolgozása és egyedi aminosavak ipari méretű előállítási területén [1, 2, 3]. Az aminosavak általában könnyen beszerezhető, közepes árú anyagok, egyre szélesebb körben használják fel különféle iparágak intermedierként és végtermék hatóanyagként.
2.1.1 Fizikai-kémiai tulajdonságok
A természetes aminosavak azonos felépítésű és eltérő szerkezetű részből állnak. Az azonos rész az -szénatom, melyhez egy aminocsoport és egy karboxilcsoport kapcsolódik. A prolin az egyetlen aminosav, amely nem tartalmaz szabad aminocsoportot. Ismeretesek még olyan nem fehérjealkotó aminosavak, amelyekben az amino- és a karboxilcsoport nem ugyanazon a szénatomon helyezkedik el, pl. L- -fenilalanin, amely gyógyszeripari intermedier vagy a - amino-vajsav (GABA) [4]. Az -aminosavak általános szerkezeti képlete:
H2N COOH CH R
2.1 ábra Az aminosavak fontosabb jellemzői:
stabil, nem illékony, fehér, kristályos anyagok
amfoter karakterű molekulák, mivel legalább egy bázikus amino- és legalább egy savas karboxilcsoportot tartalmaznak,
az -szénatom királis tulajdonságú, optikailag aktív, kivétel ez alól a glicin.
Az aminosavakat jellemzi, hogy szilárd kristályokat alkotnak, ezen belül még a legkisebb molekulatömegű (M=75,07) glicin is. Ez azzal magyarázható, hogy a karboxilcsoportja és aminocsoportja egymással belső sót képez, egy alacsonyabb energiaszintű ikerionos állapotba kerül, ami minden -aminosavra jellemző tiszta, kristályos formában [5].
Oldott állapotban az ikerionos forma aminosavanként más és más, jellemző pH értéken, az izoelektromos ponton alakul ki attól függően, hogy milyen az amino- és karboxilcsoportok aránya, illetve ezek disszociációs állandója. A funkciós csoportok számától függően a következők szerint csoportosíthatók az aminosavak:
monoamino-monokarbonsavak: semleges aminosavak, pH=6-7 körüli izoelektromos ponttal,
diamino-monokarbonsavak: bázikus aminosavak, pH>7 izoelektromos ponttal,
monoamino-dikarbonsavak: savas karakterű aminosavak, pH<<6 izoelektromos ponttal.
Az a tulajdonságuk, hogy egy egyedileg jellemző pH értéken vannak ikerionos, kifelé elektromosan semleges állapotban, számos kromatográfiás elválasztásban kihasználható, pl.
pH-gradiens ioncsere kromatográfia, izoelektromos fókuszálás. Ezen kívül az izoelektromos ponton a legkisebb az aminosavak oldhatósága, a pH-beállítás pl. a kristályos cisztin előállításának az alapja.
Másik fontos jellemzőjük, hogy az aminosavak a glicin kivételével optikailag aktívak. Az élő szervezetek fehérjéi L-aminosavakból épülnek fel, és az élő szervezetekben csekély mennyiségű szabad aminosav is L-aminosav (kivétel néhány prokarióta szervezet). Az L- és D-jelölések az -szénatom körüli abszolút konfigurációt fejezik ki, melyek az L- és D- gliceraldehid, mint referenciamolekula felhasználásával a következő térbeli szerkezeti képletekkel írhatók le [6]:
R
C COO- +H3N H
R C H NH3+
-OOC
a) L-aminosav b) D-aminosav
2.2 ábra
A vízoldhatóság függ az optikai tisztaságtól, pl. az L-fenilalanin vízoldhatósága kb. kétszeres, a racém aminosavéhoz képest, a másik aromás aminosav, a tirozin esetén a racém oldódik kb.
9-szeres mennyiségben, ugyanannyi vízben, mint a tiszta L-izomer (aminosavaknál általában a racém vízoldhatósága jobb).
Az utóbbi években figyeltek fel arra a problémára, hogy élelmiszer-alapanyagok alkalikus kezelésekor vagy hőkezelésekor, pl. tej pasztőrözésekor minden esetben történik aminosav- racemizálódás, és az így keletkezett D-aminosavak elsősorban emésztési zavarokat okoznak, az esszenciális L-enantiomerek felszívódását gátolják [7]. Hasznos alkalmazási területe a D- aminosavaknak néhány D-polipeptid gyártása vagy bioszintézise, amelyek antibiotikumként baktériumok sejtfalképződését gátolják.
A fehérjealkotó aminosavak és közülük néhány racém változatának fizikai-kémiai jellemzőit a 2.1 táblázatban foglaltam össze [8].
2.1 táblázat Aminosav
Általánosan használt rövidítés
Molekulatömeg, M
Izoelektromos pont, pI
Fajlagos forgatás, [ ]D25
Vízoldhatóság 25°C-on (g/100g víz)
L-aszparaginsav 2,98 +25,4° 0,5
DL-aszparaginsav 2,98 0 0,78
L-glutaminsav Glu 147,13 3,08 +31,5° 0,84
L-cisztein Cys 121,16 5,02 +9,7° 16,0 (20°C)
L-cisztin Cys-Cys 240,3 5,02 -212° 0,01
L-aszparagin Asn 132,13 5,41 +32,6° 3,11 (20°C)
L-fenilalanin 5,48 -35,1° 2,97
DL-fenilalanin 5,48 0 1,29
L-tirozin 5,63 -7,27° 0,045
DL-tirozin 5,63 0 0,351
L-glutamin Gln 146,15 5,65 +31,8° 3,6 (20°C)
L-szerin Ser 105,09 5,68 -6,8° 35,97 (20°C)
L-metionin Met 149,21 5,74 +23,4° 5,37 (20°C)
L-triptofán Trp 204,23 5,88 -32,15° 1,14
L-leucin Leu 131,18 5,98 +15,6° 2,19
L-valin Val 117,15 6 +26,7° 8,85
L-alanin Ala 89,09 6,01 +14,47° 16,51
L-izoleucin Ile 131,18 6,02 +40,6° 4,12
glicin Gly 75,07 6,06 0 24,99
L-treonin Thr 119,12 6,16 -28,6° 20,5 (20°C)
L-hidroxiprolin Hyp 131,13 6,3 -
L-prolin Pro 115,13 6,3 -85° 162,3
L-hisztidin His 155,16 7,64 +13° 4,29
L-lizin Lys 146,19 9,47 +25,9°
L-arginin Arg 174,2 10,76 +27,58° 14,87 (20°C)
Tyr 181,19
Asp 133,1
Phe 165,19
Az aminosavak minőségi- és mennyiségi meghatározására alkalmas analitikai módszerek közül a legfontosabbak:
papírelektroforézis (aminosav futtatás, ninhidrines színreakció)
gázkromatográfiás (GC) elemzés (származékképzéssel) [9]
királis állófázison történő folyadékkormatográfiás elválasztás
nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) elemzés (prekolonnás származékképzés, fordított fázisú elválasztás)
ioncserés oszlopkromatográfiás elemzés (posztkolonnás származékképzés, színreakció) [10].
Mind az öt módszer származékképzéses technikákat foglal magába. Az ioncserés oszlopkromatográfiás módszeren alapszik az aminosav analizátor működése. A mintában lévő, esetenként 20 féle aminosav szétválasztása pH, ionerősség és hőmérséklet gradienst alkalmazva nagyhatékonyságú kationcserélő oszlopon történik. Az elválasztást követően az oszlopról már elkülönülve távozó aminosavakat ninhidrinnel teljesen elreagáltatva a színes reakciótermékeket fotometriásan detektáljuk. A ninhidrines reakció jellemző, mennyiségi meghatározásra alkalmas, a prolin kivételével kékesibolya színű, 570 nm-en detektálható terméket ad. A prolin reakciójakor a termék sárga, ez 440 nm-en detektálható.
O O
OH OH
+ H2N CH COOH R
R C
O H
CO2+3H2O
N O
O
O
OH
2.3 ábra Ninhidrin reakció
Az aminosav analizátoros elemzési módszer specifikus, nagy érzékenységű (0,05 mol/dm3 tartomány) és nagy felbontású (20 féle fehérjealkotó aminosav tökéletes elválasztása lehetséges).
2.1.2 Az aminosavak előfordulása, aminosav források
Az élő szervezetek fehérjéi nagyrészt glicinből és 19 különféle természetes L-aminosavból származtathatók. Néhány állati szövet (pl. agy fehérállománya), növények tartalmazhatnak kevés D-enantiomert fehérjéikben, de a baktériumok sejtfalát alkotó vázfehérje D-aminosav tartalma pár százaléknyi is lehet. Ezen kívül a nem fehérjealkotó aminosavak és származékaik száma 150…200 körül van. Szabad aminosavak csak igen kis mennyiségben, sejtközi folyadékokban találhatók az élőlényekben. Aminosavak, mint alkotó molekulák a fehérjéken kívül peptidekben, polipeptidekben (pl. hormonok) fordulnak elő.
Az alábbi táblázatban néhány vázfehérje aminosav összetétele látható. A vázfehérjék egyben gyakran feldolgozóipari melléktermékekként lehetnek aminosav előállítás kiindulási anyagai.
2.2 táblázat
Az aminosavtartalom egyes hulladékfehérjék szárazanyag tartalmának %-ában Sertéssörte
(keratin)
Szaru
(keratin) Kollagén Csontliszt
Szárazanyag-tartalom 90% 95% 60% 90%
L-aszparaginsav 6,3% 6,6% 4,2% 9,3%
L-glutaminsav 13,6% 12,4% 9,0% 8,5%
L-cisztin 8,2% 5-10% 1-2% 2-4%
L-fenilalanin 2,1% 2,8% 1,8% 5,8%
L-tirozin 2,6% 4,8% - 2,2%
L-szerin 7,7% 7,2% 0,8% 4,4%
L-metionin 0,4% 0,5% 0,7% 1,1%
L-leucin 6,4% 7,5% 2,7% 10,2%
L-valin 3,8% 4,2% 2,3% 6,8%
L-alanin 4,0% 4,2% 10,0% 7,1%
L-izoleucin 2,3% 2,8% 0,9% 0,9%
glicin 3,7% 5,1% 19,1% 3,8%
L-treonin 5,4% 4,4% - 3,5%
L-hidroxiprolin - - 8,4% -
L-prolin 7,6% 4,4% 12,9% 3,9%
L-hisztidin 0,9% 4,2% 0,5% 5,8%
L-lizin 2,9% 3,4% 2,9% 7,6%
L-arginin 8,1% 8,9% 2,9% 3,6%
összes aminosav a szárazanyagtartalom
%-ában
86,0% 83,4% 79,1% 84,5%
Jellemzően ipari aminosav forrásként használható fehérjék a sertéssörte, a csontliszt, a bőripari cserzettbőr hulladék, szaru, amelyek veszélyes hulladéknak minősülő vágóhídi, bőrgyári melléktermékek (2.2 táblázat).
2.1.3 Aminosavak felhasználása
Főbb felhasználási területek:
gyógyszeripari alkalmazás,
kozmetikai-, szépségipar,
állati takarmányozás,
agrokémiai felhasználás,
A fehérjék szintézise az élő szervezetekben az aminosavak koncentrációjától és az arányuktól is függ. A szintézist az esszenciális aminosavak jelenléte határozza meg. Az esszenciális aminosavakat az adott élő szervezet önmaga nem tudja előállítani, hanem külső fehérje bevitelből (táplálkozás útján) képes hozzájutni. Az ember számára ilyen esszenciális aminosav pl. a lizin, a metionin, a treonin és a triptofán. Emberi táplálék kiegészítő szerepe lehet az aminosav készítményeknek olyan esetekben, amikor például a fent bemutatott okból egyes fehérjék szintézise gátolt. Az aminosav-kombinációk előnyösebbek lehetnek a fehérje- tápláléknál fenti esetekben, ugyanis a szervezetnek a bevitt fehérjéket a hasznosításhoz le kell bontania. Alkalmaznak még tápérték növelés céljából aminosav – fehérje keverék készítményeket is. Az aminosavak másik fontos tulajdonsága az ízfokozó hatás, pl. a vöröshagyma ízét az L-cisztin felerősíti. Ezt az élelmiszeriparban használják ki.
Az állati, formázott takarmányhoz adott aminosav keverékek (elsősorban metionin és lizin) felhasználása többszöröse az emberi felhasználásnak. Itt a fehérje, ezáltal a húsmennyiség növekedésének intenzívebbé tétele a cél.
A gyógyszeripari felhasználás nagy részét különféle infúzió oldatok készítése teszi ki, a fennmaradó rész általában gyógyszeripari intermedier, fermentációs oldatok komponense.
A kozmetikai ipar előszeretettel alkalmaz aminosavakat bőr-, testápolókban, samponokban. A bőr (epidermis), mint védőréteg újratermelődését segítik, rugalmassá teszik, illetve a bőrfelületen stabilizálják a pH-t, emulziót képeznek, és így védik a külső agresszív hatásoktól.
A kozmetikai termékek hatékony bőr-kompatibilis hatóanyaga a zsírsav – aminosav származékok nátriumsója, mint felületaktív anyag.
A mezőgazdaságban viszonylag ritkán használnak szabad aminosavakat gyomirtókban és gombaölőkben. A növekedésszabályozók blokkolásával fejtik ki hatásukat.
2.1.4 Aminosavak ipari előállításának lehetőségei
Az eljárásokat három nagy csoportra oszthatjuk:
kémiai szintézis,
mikrobiológiai szintézis,
fehérjehidrolízis.
Kémiai szintézissel főként glicint, DL-alanint és DL-metionint gyártanak.
Aminosavak előállítására jellemzőbb módszerek a mikrobiológiai és fehérjealapú eljárások.
Ma szinte bármely természetes L-aminosav előállítása lehetséges mikrobiológiai szintézissel, fermentációval. Főként L-glutaminsav és L-lizin gyártására alkalmaznak nagyhatékonyságú törzseket, de arginin, glutamin, hisztidin, i-leucin, fenilalanin, szerin, treonin, triptofán és valin L-izomerjeinek is ez az egyik használatos termelési módszere. Előnye, hogy optikailag tiszta aminosav a végtermék.
Az enzimkatalitikus eljárások a mikrobiológiai eljárásokhoz hasonlóan specifikus eljárások, egy aminosavat termelő mikroorganizmus törzs aktív enzimjét használják fel szintézisre.
Néha többkomponensű enzimcsaládot is alkalmaznak. Ezzel a módszerrel állítanak elő alanint, valint, metionint, fenilalanint és triptofánt.
Az előállítási módszerek közül az egyik megoldás a természetben előforduló aminosavak izolálása. A legnagyobbrészt fehérjékben található aminosavakat hidrolízissel lehet kinyerni A hidrolízis attól függően, hogy mi a hidrolizáló reagens, lehet lúgos, savas vagy enzimatikus eljárás. A lúgos eljárást viszonylag ritkán alkalmazzák, mert néhány aminosav jelentős mértékben racemizálódik hidrolízis közben. Savas hidrolízis során nagyon kismértékű az optikai szennyeződés, de néhány aminosav (pl. a triptofán) érzékeny a savas közegre és hidrolízis közben elbomlik. Az enzimkatalitikus hidrolízis előnye, hogy nem jár optikai szennyeződéssel, hátránya a költségigénye. Savas és lúgos hidrolízis utáni reakcióelegy feldolgozása szűréssel és semlegesítéssel kezdődik. Ekkor nagy sókoncentrációjú aminosav, peptid-keverék oldatot kapnak.
Egyes aminosavak egyedi kinyerésekor a rájuk jellemző izoelektromos pontjukat használják ki. A cisztin és a tirozin pl. pH-beállítás hatására szilárd, szűrhető kristályos anyagként kicsapódik. Más aminosavakat ioncserélő gyantával töltött oszlopon szeparálnak.
2.1.5 Aminosavak szorpciós tulajdonságai
Aminosavakat tartalmazó oldatból történő folyadékkromatográfiás elválasztásnál a szorpciós tulajdonságok különbözősége, illetve paraméterfüggése vizsgálandó az elválasztás tervezésekor. Az állófázis a fordított fázisú preparatív folyadékkormatográfiás gyakorlatban legtöbbször egy térhálósított és szabályozott pórusméretű polimer, kopolimer vagy funkciós csoport(ok)kal ellátott kopolimer gyanta. A funkciós csoporttal nem rendelkező gyantákon adszorpciós egyensúlyokkal, a gyengén savas-, ill. gyengén bázikus gyantákon (pl. a dimetil- aminnal funkcionalizált gyantákon) egyidőben ioncserés és adszorpciós egyensúlyi folyamatokkal jellemezhető az aminosavak megkötődése. Ezenkívül célszerű vizsgálni még aminosav elválasztás céljára szubsztituált gyengén poláros gyantákat, pl. brómozott sztirol- divinilbenzolokat. Az adszorbens gyanták sokfélesége miatt – kémiai összetétel, polaritás, hidrofóbicitás, szemcseméret, pórusátmérő – döntő lépés a legmegfelelőbb állófázis kiválasztása. Az adszorbensválasztás első lépése, hogy azonos paraméterek mellett meghatározzuk az aminosav izotermákat a szóba jöhető adszorbenseken.
Az aminosavak adszorpciós egyensúlyainak mérése adszorbens gyantákon az alábbi módszerekkel lehetséges:
Keverős üstben végzett egyensúlyi telítés
Egy aminosav-törzsoldatból – ami lehet egy- vagy több komponensű – hígítással a mérni kívánt koncentráció tartományban oldatsorozatot készítünk, és minden ismert térfogatú oldathoz pontosan bemért gyantamennyiséget adunk. A gyanta hozzáadása előtt, és megfelelő ideig történő kevertetés után az oldatokból mintát veszünk, és meghatározzuk az aminosav koncentrációt. Az anyagmérleg alapján számítható, hogy mennyi aminosav kötődött meg a gyantán.
Dinamikus módszerek, oszlopkromatográfiás mérés Injektálásos módszer
A retenciós térfogat és a holttérfogat hányadosából számítható az egyensúlyi megoszlási hányados, ami lineáris tartományban – kisebb koncentrációknál, ill.
gyengén kötődő komponenseknél – az izoterma meredeksége. A módszer kis koncentrációknál alkalmazható előnyösen, illetve ha kis mintamennyiség áll rendelkezésre.
Frontális módszer
Egy oszlopon különböző koncentrációjú aminosav oldatokkal végzünk frontális adszorpciós – deszorpciós méréseket. A betáplált aminosav mennyiség és a gyantaágyon átmenő aminosav mennyiség közötti különbség a megkötődött aminosav mennyisége. Ismert gyantamennyiséggel töltött oszlopon számítható az egységnyi adszorbens tömegre jutó aminosav tömeg. A módszer előnye, hogy oszlopon hajtjuk végre ugyanazzal a frontális módszerrel, mint a tervezendő preparatív elválasztást, A mérésből ezért nem csak egyensúlyi, hanem kinetikai jellemzők is meghatározhatók (pl. a deszorpció sebessége). A módszer nagy mintamennyiséget igényel és hosszú a mérési idő. Többkomponensű izotermák is mérhetők frontális módszerrel.
Többlépcsős frontális módszer
Oldószerrel egyensúlyban lévő oszlopra egyre nagyobb koncentráció lépcsőkben adjuk az aminosavoldatot, mindig megvárva az áttörési görbe plató-szakaszát. Előnye az egylépcsős módszerrel szemben, hogy nincs akkora kezdeti koncentrációkülönbség a betáplált oldat és az oszloppal egyensúlyban lévő oldat között (egyensúly-közeli állapot elérése gyorsabb), ill. hogy nem kell minden mérési pont után deszorpciót végezni az újabb mérés megkezdése előtt. Szintén alkalmas többkomponensű izotermák meghatározásához.
Egyéb módszerek: bonyolultabb, de pontosabb eredményt adó módszerek, pl.
perturbációs módszer (frontális módszer és injektálás kombinációja) [11].
Az aminosavak, peptidek, polipeptidek fordított fázisú polimer gyantákon történő adszorpciós tulajdonságait a meglévő szakirodalomban a következő jellemzők függvényében vizsgálták:
gyantatípus – adszorbeátum kombináció,
hőmérséklet,
pH érték,
oldószer-összetétel
elektrolit koncentráció.
Adszorpciós egyensúlyok hőmérséklet-függése
A hőmérsékletfüggés abból adódik, hogy az adszorpció hőforgalommal járó folyamat.
Grzegorczyk és Carta kísérleti úton és energetikailag vizsgálták az összefüggést az adszorpciót korlátozó hő és az adszorpciós egyensúly között [12].
2
ln 0
RT H T
K (1)
Ahol: K – adszorpciós egyensúlyi állandó (felületre normált) (1/m2) T – hőmérséklet (K)
H0 – adszorpciós hő (J/mol)
Állandó H0 mellett, integrálás után a K adszorpciós egyensúlyi állandó egy preexponenciális K0 határértékkel számítható:
RT
e H
K
K 0 0/ (2)
A K0 tényező az adszorpció entrópiaváltozásától függ:
R S
K /
ln 0 0 (3)
A hőfelszabadulással járó adszorpciós folyamatok egyensúlya a hőmérséklet növelésére a deszorpció felé tolódik el. Ilyen esetben alacsonyabb hőmérsékleten nagyobb, a hőmérsékletet emelve egyre kisebb adszorpciós egyensúlyi állandót mérhetünk.
Rodrigues és munkatársai fenilalanin adszorpciós egyensúlyát vizsgálták a hőmérséklet függvényében és ez alapján számítottak és modelleztek paraméteres szivattyúzást [13].
A folyadékfázis pH-jának aminosav adszorpcióra gyakorolt hatása
Grzegorczyk és Carta igazolták, hogy az adott aminosav izoelektromos pontján mérhető a legkisebb adszorpció polimer adszorbenseken, ettől eltérő pH-kon kismértékben emelkedik a gyantafázisbeli koncentráció [12].
Az adszorpciós minimum az izoelektromos ponthoz tartozó pH-n az aminosav ikerionos állapotával hozható összefüggésbe. Ebben az állapotban a legerősebb a molekula ionos jellege (belső só), ettől pozitív és negatív irányba eltérő pH-n csökken az ionos jelleg.
A folyadékfázis oldószererősségének hatása az aminosavak adszorpciójára
Az oldószererősség fogalmát Snyder [14] vezette be. Fordított fázisú, hidrofób tölteteken a víz a gyenge oldószer, az oldószer molekula polaritás csökkenésével egyre erősebb az oldószer.
Legtöbbször valamilyen alkoholt adnak a vízhez, ha az oldószererősség növelése a cél. A metanol- és propanolkoncentráció függvényében vizsgálva különböző aminosavakkal kapcsolatban megállapították, hogy az alkoholok, főként a kevésbé poláris propanol erősebb
eluáló hatást biztosítanak már viszonylag kis koncentrácóban is, így kromatográfiás alkalmazás esetén töltet-regeneráláshoz előnyös lehet alkohol gradiens alkalmazása.
Az elektrolitkoncentráció hatása az aminosavak adszorpciójára
Hashimoto és szerzőtársai [15] fenilalanin adszorpcióját vizsgálták XAD-4 poliaromás gyantán a NaCl-koncentráció függvényében. A só koncentrációjának növelésével megnőtt az adszorbeált fenilalanin mennyisége, nőtt a gyanta kapacitása. Ennek magyarázata lehet, hogy elektrolitmentes vizes oldatban a fenilalanin poláris része hidratált, és az viszonylag jól oldódik. Erős elektrolit jelenléte esetén a só ionjai saját hidrát burkuk kialakításához vizet vonnak el tőle, ezért megszűnik a hidrátburok (kisózás), és ekkor a másik kölcsönhatás lesz erősebb: a polimer adszorbens gyanta és a fenilalanin aromás gyűrűi közti van der Waals kölcsönhatás. A kísérletek is igazolják ezt, ugyanis a fenilalanin, a tirozin, illetve a triptofán esetén mérhető a legnagyobb adszorpciós többlet, míg glicinnél nem tapasztalható. A sókoncentráció növelésével növekszik a megkötött aminosav mennyisége.
Fenilalanin adszorpciója különböző adszorbenseken
Egy adott aminosav adszorpciója különböző gyantákon igen eltérő lehet a polaritás, a hidrofób jelleg, a pórusméret és a fajlagos felület függvényében.
A fenilalanin előnyös adszorpciós tulajdonságok vizsgálatára, mert a fenilalanin molekula részben apoláris, részben poláris részt tartalmaz.
Kémiai összetétel alapján a legelterjedtebbek az etilvinilbenzol-divinilbenzol és a sztirol- divinilbenzol kopolimer gyanták (pl. XAD-4, XUS-43444). Léteznek továbbá a szénhidrogén polimerláncokon enyhén poláris csoportokat tartalmazó (brómozott, klórmetilezett) adszorbensek is (XUS-43493, 40285 és 43444). A tisztán adszorpciós, hidrofób gyanták közül a XAD-4-en kötődik legjobban a fenilalanin, a gyengén hidrofil gyanták közül és az összes vizsgált gyantát is tekintve a legnagyobb fajlagos felülettel rendelkező XUS-43444 a legnagyobb kapacitású fenilalaninra nézve [12]. Megállapítható, hogy a legnagyobb adszorpciós kapacitást fenilalaninra a fenilalaninhoz kémiai szempontból „hasonló”, tehát gyengén poláris gyanták mutatják.
2.2 A folyadékkromatográfia elméleti áttekintése
2.2.1 Történeti áttekintés
A kromatográfia az elválasztási műveletek családjába tartozik, melynek során egy többkomponensű áramlásban lévő fluid fázisból választunk szét egyedi komponenseket vagy többkomponensű frakciókat az elválasztáshoz megosztó fázist (másnéven állófázist, oszlopot vagy vékonyréteget) felhasználva. A kromatográfiát eleinte különféle anyagok minőségi kimutatására használták, felfedezése Cvet nevéhez fűződik, aki növények zöld- és sárga színanyagát választotta szét kalcium-karbonát töltetű oszlopán.
Az analitikai kromatográfia széleskörben használt, mennyiségi meghatározásra alkalmas módszercsalád, amely nagyon sok módszert foglal magába (HPLC módszerek, IC, GC és csatolt technikák).
A preparatív folyadékkromatográfia célja nagytisztaságú és/vagy nehezen elválasztható anyagok előállítása. Az analitikai kromatográfia a preparatív művelet paramétereinek számításánál és optimálásánál a számítógépes modellezés mellett ma is fontos tervezési tényező, a méretnövelési számításokhoz fontos mérési adatokkal szolgál.
A preparatív folyadékkromatográfia csoportosítható aszerint, hogy szakaszos vagy folyamatos műveletről van-e szó. A szakaszos preparatív kromatográfia hátránya, hogy elég nagy műveleti holtidőkkel kell számolni, az elválasztásra fordított műveleti időt általában regenerálási műveleti időnek kell követni. Más megközelítésban a szakaszos kromatográfiában az adszorbens csak kismértékben kihasznált a művelet egésze során.
Ezért többféle folyamatos eljárást fejlesztettek ki, mint például a forgógyűrűs kromatográfia, a recirkulációs egyoszlopos kromatográfia és a szimulált mozgóréteges folyadékkromatográfia.
2.2.2 A kromatográfia alapfogalmai
A kromatográfiás módszerek olyan dinamikus elválasztási módszerek, amelyek egymáshoz fizikai-kémiai tulajdonságaikban nagyon hasonló anyagok minőségi és
Az elválasztás a komponenseknek az álló és a mozgó fázis között létrejövő eltérő megoszlása következtében valósul meg.
*
*
] [
] [
A A
A c
K q (4)
Ahol: KA – az A komponens megoszlási hányadosa
[cA]* - az A komponens egyensúlyi koncentrációja a folyadékfázisban [qA]* - a A komponens egyensúlyi koncentrációja az állófázison
A és B komponens kromatográfiásan elválasztható egymástól, ha az adott folyadékfázis – állófázis rendszerben a megoszlási hányadosuk eltér egymástól:
KA KB
Az oszlopkromatográfia fontos dinamikus jellemzője az elméleti tányérszám (Number of Theoretical Plates, NTP), amely megmutatja, hogy a teljes oszlophosszon az álló- és mozgófázis közötti megoszlás elméletben hányszor megy végbe. Az elméleti tányérmagasság (Height of Equivalent Theoretical Plates) az oszlophossz és az elméleti tányérszám hányadosa. Minél kisebb az elméleti tányérmagasság, annál hatékonyabb lehet az elválasztás. Az NTP és a HETP jellemző az oszlopra (töltetre), ill. egyedileg az adott komponensekre, és az áramlási sebesség függvénye.
A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (High Performance Liquid Chromatography, HPLC), olyan oszlopkromatográfiás módszer, amelyben a töltet 3…100 m szemcseátmérőjű, az oszlop nagy elméleti tányérszámmal jellemezhető, így hatékonyabb a komponensek szétválasztása. A HETP optimális körülmények között tapasztalati képlet (5) alapján a töltet szemcseátmérőjének körülbelül kétszerese, de az áramlási sebesség növelésével nő, miközben NTP csökken.
dp
HETP 2 (5)
Ahol: dp – a töltet átlagos szemcseátmérője
Oszlopkromatográfiás alapfogalmak
A retenciós idő a kromatográfiás oszlopon való áthaladáshoz szükséges idő, amely adott rendszerben ugyanazon paraméterek mellett a komponensre jellemző időadat, két részből tevődik össze:
N
R t t
t 0 (6)
Ahol: tR – bruttó retenciós idő – az az időtartam, mely az injektálástól a komponesnek az oszlop kimenetén való megjelenéséig eltelik
t0 – holtidő (az oszlop összes ürestérfogatából származó tartózkodási idő) – az oszlop összes ürestérfogata az oszlop teljes térfogatának és az összes porozitásnak a szorzata, az összes porozitás a töltet szemcsék közötti és a szemcséken belüli porozitás összege
tN – a vizsgált komponens adszorbensen való tartózkodásának ideje
A VN nettó retenciós térfogat azt a mozgófázis térfogatot jelenti, amely az elválasztandó komponenst a kromatográfiás oszlopon éppen eluálja. Tekintettel arra, hogy az eluensnek fel kell tölteni az oszlop összes ürestérfogatát is (V0) – mely tartalmazza a szemcsék közötti ürestérfogatot és a töltetszemcséken belüli pórustérfogat értékét, definiálható egy úgynevezett bruttó retenciós térfogat:
N N
R t F t F V V
V 0 0 (7)
Ahol: F – a mozgófázis áramlási sebessége
A retenciós időre vonatkozó összefüggést a retenciós tényezővel vagy másnéven kapacitási tényezővel is felírhatjuk:
) 1
( ,
0 0 ,
0 kt t k
t
tR (8)
Ahol: k’ – retenciós (kapacitási) tényező
A retenciós (kapacitási) tényező megmutatja, hogy a nettó retenciós idő hányszorosa az ürestérfogatból származó holtidőnek, tehát a töltet és az adott komponens kölcsönhatására jellemző érték. Két komponens akkor választható el könnyen egymástól, ha kapacitási tényezőik egymástól minél nagyobb mértékben térnek el. A két komponens ugyanazon tölteten mérhető kapacitási tényezőinek hányadosa mutatja meg a rendszer szelektivitását.
0 0 , 0
0 , ,
V V V t
t
ki tRi Ri (9)
0 2 ,
0 1 , , 2
, 1 1
2 t t
t t k k
R
R (10)
Ahol: i – komponens index
1 – jobban kötődő komponens indexe 2 – kevésbé kötődő komponens indexe
1
2 – szelektivitási tényező
A kromatográfiás oszlop hatékonyságának jellemzője, hogy egy gyakorlatilag nem adszorbeálódó jelzőanyag injektálása milyen tartózkodási idő válaszfüggvényt eredményez, azaz a kromatográfiás sávok (csúcsok) milyen szélesek. A sávszélesedés segítségével definiálható az oszlop hatékonyságára jellemző érték, az elméleti tányérszám. Az elméleti tányérszám meghatározása azon a feltételezésen alapul, hogy a rendszer a Dirac- delta bemenetre Gauss- féle eloszlású kimenettel válaszol:
2
tR
NTP (11)
Ahol: – a kromatográfiás csúcs sávszélessége
Az elméleti tányérmagasság:
NTP
HETP L (12)
Az elméleti tányérmagasság áramlási sebességtől való függését a van Deemter egyenlet írja le:
v v C A B HETP
(13)
Ahol: A, B, C: állandók:
A 2×dp az örvénydiffúziós koefficiens
B – axiális diffúziós hatást figyelembevevő koefficiens C – kinetikai tényező
v – a mozgófázis lineáris áramlási sebessége.
Az adszorpciós folyadékkromatográfia elmélete, izotermatípusok
Az adszorpciós folyadékkromatográfia esetén a folyadékfázisban jelenlévő komponensek és a porózus szilárd fázis aktív helyei között másodlagos kötőerők létesülnek. A szilárd fázist adszorbensnek, a megkötött molekulákat adszorbeátumnak nevezzük. Amennyiben egy edényben adszorbenst adunk egy egykomponensű oldathoz, az adszorbeátum és az oldott molekulák egyensúlya egy bizonyos idő után beáll, tehát ugyanannyi szolvatált molekula adszorbeálódik, mint amennyi adszorbeált molekula deszorbeálódik. Az adszorpció egyensúlyának leírására izotermákat használunk.
Lineáris izoterma
Lineáris izotermának nevezzük az olyan összefüggést, amelyben a vizsgált komponens adszorbensbeli és fluidfázisbeli koncentrációja között lineáris a kapcsolat:
k k
k K c
q (14)
Ahol: qk – a k-adik komponens koncentrációja az adszorbensben, ck – a k-adik komponens koncentrációja a fluidfázisban, Kk – a k-adik komponens megoszlási hányadosa.
A lineáris összefüggés általában a valós rendszerekre csak nagy körültekintés mellett használható, mert általában csak kis koncentrációknál érvényes.
Langmuir - izoterma
Az alábbi, gázokra és folyadékokra is általánosan érvényes adszorpciós izotermaegyenletet Langmuir (15) vezette le a következő egyszerűsítéseket feltételezve:
Minden aktív centrum egy részecskét köt meg, az adszorpció legfeljebb monomolekuláris réteget alkothat a felületen.
Az adszorbeált molekulák között nincs kölcsönhatás.
Az adszorbens felületén adott számú, energetikailag egyenértékű aktív centrum található.
Az adszorpciós réteg és az adszorbeálandó komponens között dinamikus egyensúly van.
A Langmuir - egyenlet matematikai alakja:
k k
k k
k b c
c q a
1 (15)
Ahol: ak, bk – a k-adik komponens ún. Langmuir – állandói, qk – a k-adik komponens koncentrációja az adszorbensben, ck – a k-adik komponens koncentrációja a fluidfázisban.
A Langmuir-féle izoterma típus sok esetben jól alkalmazható folyadékfázisban nagyobb koncentrációban oldott komponens szilárd fázison történő adszorpciójának leírására is.
„Bi - Langmuir" - izoterma
Előfordulhat, hogy az adszorbens felületén elhelyezkedő aktív centrumok nem tekinthetők energetikailag egyenértékűnek. Ilyen eseteknél szokás alkalmazni ezt a fajta izotermatípust, amely két adszorpciós szempontból eltérő aktív centrummal rendelkező felületet feltételez. A modell így a két független részizoterma összege lesz:
k k
k k k k
k k
k b c
c a c b
c
q a 2
2 1
1
1
1 (16)
Ahol: a1k,a1k,bk2,bk2: a Langmuir - egyenletek állandói,
qk - a k-adik komponens koncentrációja az adszorbensben, ck - a k-adik komponens koncentrációja a fluidfázisban.
Versengő Langmuir - izoterma
Az egykomponensű rendszerekre vonatkozó Langmuir - izoterma többkomponensű rendszerekre való kiterjesztésével kaphatjuk meg ezt az izotermatípust:
N
j j j k k k
c b c q a
1
1
(17) Ahol: ak, bk – az egykomponensű izoterma állandói,
N – a komponensek száma.
Ezt az izoterma-egyenletet akkor alkalmazzuk, amikor több komponens nagyobb koncentrációban van jelen a folyadékfázisban, hasonló mértékben kötődnek a szilárd fázison, és ezért a komponensek egymás adszorpcióját is befolyásolják, ugyanis az adszorbensen lévő aktív centrumok száma véges.
Preparatív folyadékkromatográfiás műveletek összehasonlítása
A preparatív folyadék kromatográfiás műveleteket üzemvitel szerint szakaszosként ill.
folyamatosként csoportosítjuk. A szakaszos üzemvitelű kromatográfiában injektálás, termékelvétel, regenerálás munkafázisokkal dolgozunk. Egy folyamatos üzemű berendezésben ezek a részfolyamatok hely szerint differenciáltan, de időben folyamatosan játszódnak le. Ahhoz, hogy folyamatossá tudjuk tenni a műveletet, első közelítésben szükség van az adszorbensnek a betáplálás pontjához képest történő relatív elmozdulására.
2.4 ábra
Folyamatos ellenáramú kromatográfia elve
A folyamatos preparatív folyadék kromatográfiával a következő előnyöket érjük el:
Nagyobb termelékenység: nincs vagy elhanyagolható a műveleti holtidő.
Fázisok recirkulációja jó fajlagosok, tehát jó adszorbens- és oldószer kihasználtság.
Nagy kihozatalok, kis komponensveszteségek: a komponensek koncentráció- sávjainak átlapolásából nincs veszteség, ugyanis a termékeket folyamatosan vesszük el a rendszer azon részeiről, ahol tiszta komponensek vannak.
Nagyobb termékkoncentrációk: a nagyobb koncentráció miatt a termék további feldolgozásához (kristályosítás, bepárlás, vákuumbepárlás) kisebb energiaráfordítást igényel.
Ha szakaszos kromatográfiát tervezünk, az ott megkapott paraméterek könnyen átvihetők a folyamatos kromatográfiára.
A 2.4 ábrán is látható, hogy a folyamatos ellenáramú műveletek elsősorban két komponens szétválasztására alkalmasak, de megoldható az is, hogy többkomponensű
Álló fázis
Mozgó fázis
A+B
A B
rendszerből egy célkomponenst izoláljunk a többitől, vagy többkomponensű, de hasonló tulajdonságú frakciókat vegyünk el.
Ahhoz, hogy eldöntsük, az adott elválasztási művelethez szakaszos vagy folyamatos üzemű berendezést alkalmazzunk, látni kell a folyamatos kromatográfia hátrányait is:
Nagyon érzékeny a műveleti paraméterek megválasztására.
Alapvetően két termékes művelet (két termékelvétel lehetséges egyidőben, folyamatosan).
Magasabb beruházási költségekkel számolhatunk, ugyanis több oszlop, több szivattyú, több szerelvény kell és szinte elengedhetetlen, hogy automatizált legyen a rendszer.
2.2.3 Folyamatos preparatív folyadékkromatográfiás műveletek, szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfia
Az adszorbens fázis folyadékáramláshoz viszonyított relatív elmozdulására a legelső megoldás az ún. forgógyűrűs kromatográf (Rotating Annular Chromatograph) volt.
Ezzel az elrendezéssel a fluid fázis és a forgó mozgást végző gyűrű geometriájú szilárd fázis között keresztáram érhető el. Többkomponensű szétválasztásra is alkalmas.
Ellenáramú eljárással a létező adszorpciós kapacitás még jobb kihasználtsága érhető el.
Ezt az adszorbens fázis folyadékárammal szembeni tényleges mozgatásával (True Moving Bed, TMB), vagy egy sorba kapcsolt oszloprendszer meghatározott időközönként a betápláláshoz képest történő relatív elforgatásával érhetjük el. Az utóbbi eljárást szimulált mozgóréteges (Simulated Moving Bed, SMB) kromatográfiának nevezzük.
A TMB (2.5a ábra) egyoszlopos ellenáramú eljárás, az állófázis az oszlopon belül a gravitációs erőhatás következtében folyamatosan csúszik lefelé. A szilárd fázis oszlop tetejére történő vezetésével kapcsolatos problémák miatt nem terjedt el széleskörben, főként petrolkémiában alkalmazzák. (TMB adszorber).
a) b)
2.5 ábra a) TMB, b) SMB
I, II, III, IV – zónák vagy másnéven szegmensek, F – szétválasztandó minta betáplálás (továbbiakban feed), E – extraktum a jobban kötődő komponensben dúsítva, R – raffinátum a kevésbé kötődő komponensben dúsítva, D – eluens (deszorbens), S – friss
eluens, Rec – recirkulált eluens, A Rec – adszorbens visszavezetés, CM – oszlopok relatív elmozdulása
Kevesebb technikai akadály és jobb megvalósíthatóság jellemzi a TMB-hez hasonló működési elvű SMB-t (2.5b ábra). A szimulált ellenáramot sorbakapcsolt fixágyas oszlopokon hozhatjuk létre úgy, hogy valamilyen műszaki megoldással adott időközönként megfelelően cseréljük az egyes oszlopokra menő betáplálási és az oszlopokról távozó elvételi folyadékáramokat [16].
Az SMB működési elve
A szimulált mozgóágyas kromatográf (SMB) alapvetően a valós mozgóágyhoz (TMB) hasonlóan működik.
D I II III IV
Eluens F E R
A Rec S+Rec Rec
S D
CM IV
III
S+Rec F R
E
I II
Rec
S
2.6 ábra
TMB a folyadékáramokkal és a szilárd fázis (adszorbens) mozgási irányával A TMB működésének rövid leírása: egy oszlopon folyamatosan, felülről lefelé egyenletesen mozgó adszorbensen alulról felfelé ellenáramban halad a folyadékfázis.
Az oszlop oldalán, középen az A és B komponenst tartalmazó minta bemenő áram (feed), az oszlop oldalán fent a raffinátum elvétel, alul az extraktum elvétel csonkja van.
Az oszlop legalján friss eluens betáplálás helye, legfelső pontján a regenerált eluens elvétel helye található (2.6 ábra). Megfelelő adszorbens mozgatási sebesség, megfelelő eluens, feed, extraktum és raffinátum térfogatáramok, ezáltal megfelelő zónánkénti térfogatáramok alkalmazásával kialakul egy olyan stacioner állapot, amelyben az A és B komponens koncentrációprofiljai az oszlopon belül állandósulnak. A jobban kötődő B komponens a mozgó fázis haladási irányát tekintve az oszlop elején, a kevésbé kötődő A az oszlop végén helyezkedik el. Ez lehetővé teszi, hogy folyamatosan kapjuk a két tiszta komponenst az extraktumban, ill. a raffinátumban.
Az SMB működése ettől annyiban tér el, hogy a TMB zónáinak megfelelő SMB zónákban egy vagy több fix töltetágyas oszlop van sorbakapcsolva, a töltet mozgását a térfogatáramok adott időközönkénti elmozdításával „szimuláljuk” (erre többféle technikai megoldás létezik). Különbség tehát, hogy SMB esetén nem folytonos a szilárd fázis mozgatása, hanem ún. „szimulált mozgatás” történik, ezért az oszlopokon a
Friss eluens
Extraktum Raffinátum Adszorbens
Feed
koncentrációprofilok sem állandóak, de kvázi-stacionárius állapotban, egy-egy taktus azonos időpillanatához tartozó oszlopprofilok megegyezőek. Ha egy olyan SMB készüléket tekintünk, amely minden egyes zónájában 1 oszlop van, akkor a következő folyamattal írható le a működése: taktusváltáskor az első zóna oszlopa kerül a negyedik zónába, a negyedik a harmadikba, a harmadik a másodikba és a második az első zónába.
A koncentrációprofil a taktusváltások között folyamatosan változik, a komponensek ilyenkor a folyadékfázissal egy irányba haladnak. Az állófázis viszont csak adott időközönként, taktusidőnként mozdul el a mobil fázis áramlási irányával ellentétes irányba. Minél több oszlopot tartalmaz az SMB-LC, tehát egy zónára minél több oszlop jut, és minél rövidebb a taktusidő, annál inkább hasonlít egy valós mozgóágyhoz, viszont a gyakorlatban egyre inkább törekednek a minél kevesebb oszloppal megvalósítható SMB elválasztások megvalósítására.
Zárt és nyitott SMB folyadékkromatográf
A zárt, 4 zónás SMB kromatográfban megvalósul mind a folyadékfázis, mind a szilárd fázis regenerálása és recirkulációja. Vannak nyitott négyzónás megoldások, ahol szintén megvalósul mindkét fázis regenerálása, de a folyadékfázist inkább összegyűjtik és más technológiában hasznosítják vagy feldolgozás (pl. desztilláció) után vezetik vissza a folyamatba. Ez akkor lehet előnyös, ha a folyadékfázis többkomponensű és valamelyik oldószerkomponens adszorpciója nem elhanyagolható, ami azt eredményezi, hogy a regenerált folyadékelegy összetétele akár kismértékben is megváltozik a betáplált folyadékelegyéhez képest. (A folyadékelegy alatt itt az SMB deszorbenst, másnéven eluenst értjük, ami sok esetben megegyezik vagy legalábbis összetevőiben megegyezik a szétválasztandó komponensek oldatát képező oldószerrel).
Négyzónás SMB-ben a IV-es zóna feladata, hogy a kevésbé adszorbeálódó komponenst visszatartsa, és a zóna végén távozó folyadékban csak oldószerkomponensek távozzanak. Ha a kevésbé kötődő komponens olyan kismértékben adszorbeálódik, hogy csak nagyon kevés oldószert tudunk regenerálni a IV-es zónán, ill. ha az oldószer pl.
víz, akkor háromzónás SMB-t célszerűbb alkalmazni. Ekkor a raffinátum az SMB harmadik zóna végén távozik. A háromzónás nyitott SMB előnyei:
A IV-es zóna hiánya leegyszerűsíti a műveletet, ezért sokszor eredetileg négyzónásra tervezett művelet háromzónásra történő egyszerűsítésével csökkenthető
Az utolsó zónából kilépő folyadékáram nem kerül vissza a friss oldószer áramba (nincs folyadékrecirkuláció), az extraktum áramban nyert komponens tisztasága könnyebben biztosítható.
2.7 ábra
a) 4 zónás zárt kör, b) 3 zónás nyitott kör fehér nyíl: szilárd fázis szimulált mozgásának iránya
fekete nyíl: folyadékfázis áramlási iránya
Az SMB preparatív folyadékkromatográfia műveleti paramétereinek meghatározása
A megfelelő hatásfokú elválasztáshoz – tiszta A és tiszta B komponens kinyeréséhez pontosan meghatározott és pontosan beállított zónánként eltérő folyadék térfogatáramokra és taktusidőre van szükség.
Az SMB paramétersor meghatározáshoz és optimáláshoz kapcsolódó módszereket a kezdetekben – Guiochon [17, 18], Seidel-Morgenstern [11, 19] és Morbidelli vezetésével – három nagynevű kutatási csoport dolgozta ki.
A betáplálási (eluens – D, szétválasztandó mintabetáplálás – F) és elvételi (extraktum – E, raffinátum – R) térfogatáramokat és a taktusidőt legegyszerűbben Morbidelli és társai által kidolgozott, lineáris adszorpciós egyensúlyon alapuló elmélet alapján tudjuk meghatározni [20]. A módszer független adszorpció mellett lineáris izotermákat feltételez. A térfogatáramokkal, az oszlophosszal és az összporozitással felírt Morbidelli paramétereknek meg kell felelniük az egyes zónákra jellemző kritériumoknak. Egy
Eluens E
R F
II
III IV
I Eluens E
R F
I
II
III
a) b)
kiindulási tervezési paraméterrel (pl. taktusidő) a többi számítható a kritériumok figyelembevételével. Az így kapott értékek egy kísérleti laboratóriumi mérésben, a kezdeti paraméter meghatározáshoz mindenképpen alkalmasak. A Morbidelli módszer levezetésének bemutatásától itt eltekintünk. Lényege, hogy az SMB zónáira egy meghatározott taktusidő és a komponensek egyensúlyi megoszlási hányadosa (lineáris egyensúly) alapján a komponensek mozgási sebességét meghatározva olyan, zónánként különböző térfogatáramokat kell meghatározni, melyek szerint:
a) az I-es zónából a jobban kötődő komponens (továbbiakban A komponens) a taktusidő vége előtt teljesen távozik
b) a II-es zónából a kevésbé kötődő komponens (továbbiakban B komponens) a taktusidő vége előtt maradéktalanul távozik
c) a III-as zóna végén az A komponens nem tör át d) a IV-es zóna végén a B komponens nem tör át
A 2.5 b) ábra jelöléseit alapul véve a négyzónás SMB térfogatáramai a következők:
– I. zóna: D
– II. zóna: D - E
– III. zóna: D - E + F – IV. zóna: D - E + F - R.
A fenti, a) b) c) d) feltételeket tekintve az egyes zónákra az alábbi Morbidelli- kritériumok írhatók fel:
I-es zóna:
A f
I K
L L A T
D
m (1 ) (18)
Ahol: mI – I-es zónára vonatkozó Morbidelli-paraméter T – taktusidő
L – oszlophossz
Af – oszlopkeresztmetszet E – összporozitás
KA – A komponens egyensúlyi megoszlási hányadosa
