Általános alkalmazott enzimológiai ismeretek
Dr. Fehér Csaba BME ABÉT
Biofinomító Kutatócsoport
Mezőgazdasági iparok technológiája
• Keményítőipar
- Mikrobiális enzimek - Amilázok
- Oldott és rögzített enzimek
• Söripar
- Növényi enzimek, maláta
• Szeszipar
- Nyersanyag előkészítés (hidrolízis), amilázok, cellulázok, hemicellulázok
• Cukoripar
- Dextranázok (Leuconostoc mesenteroides dextránt szintetizál a szacharózból)
• 1915-ben: Mosószerekbe tripszin hatású enzimet tesznek.
• 1969-ben: Az NSZK-ban az összes mosószerek 80%-a tartalmazott enzimet , főleg proteázokat, de kísérletképpen: lipázokat, amilázokat, pektinázokat, oxidoreduktázokat.
• 1971-ben: Rengeteg allergiás panasz, csökkentik a proteázok mennyiségét a mosóporokban, granulálják (porzás elkerülése)
• Manapság a mosószerek 80-85 %-a tartalmaz enzimeket.
Történeti áttekintés - ipari enzimek
• 1970 óta: Glükóz izomeráz nagyipari felhasználás -amilázzal és amiloglükozidázzal együtt (Keményítőből izocukor előállítás)
• 1965 óta mikrobiális úton előállított rennin (Mucor miehei)
• Pektinázok a gyümölcslégyártó iparban egyre nagyobb jelentőségre tesznek szert (Aspergillus niger, Aspergillus wentii)
• Lipázokat, mind gomba eredetűeket ( Aspergillus, Mucor, Geotrichum családokból), mind bakteriális eredetűeket az emésztés segítésére
(gyógyszerekben)
• Penicillin acilázok: a mikrobiális úton előállított penicillin G-ből
Történeti áttekintés - ipari enzimek
Az összes használt enzim minimum 75%-a hidrolítikus enzim
Proteázok: legnagyobb mennyiségben alkalmazott enzimek (kb.40%) a tejiparban (koaguláló szerek), valamint a mosószeriparban
Szénhidrátbontó enzimek: a második legnagyobb %-ban alkalmazott enzimcsoport: sütőipar, szeszipar, keményítőipar, textilipar
Az enzimfelhasználás megoszlása
Az enzimek biológiai rendszerekben (élő szervezetekben) szintetizálódnak és kémiai reakciókat katalizálnak.
Egyrészt az élő szervezetekben a sejtek működéséhez szükséges anyagátalakításokat és energiatermelő folyamatokat gyorsítják
Másrészt az ipari technológiákban különböző technológiai lépések reakcióját gyorsítják.
Csak a termodinamikailag lehetséges folyamatokat katalizálják, a
kémiai reakció egyensúlyát nem változtatják meg, az egyensúly tehát nem változik meg, csak az idő, ami alatt az egyensúlyt elérjük.
Az enzimek csökkentik a katalizált reakció aktiválási energiáját.
Az enzimek mindkét irányú reakciót katalizálják, (reverziós termékek
Enzimek - alapok
Az enzimek katalitikus hatása óriási:
CO2 + H2O H2CO3 Enzim: karboanhidráz
Egyetlen enzimmolekula hatására 105 mol CO2 hidratálódik
másodpercenként. A sebesség 107-szer nagyobb, mint a katalizálatlan reakció sebessége.
Glükozid kötés hidrolízise 25oC-on 1 mol katalizátor koncentráció hatására 108-szor gyorsabban játszódik le enzim (glükozidáz)
jelenlétében, mint HCl katalízissel.
Enzimek - alapok
Enzimaktivitás, az enzimek legfontosabb tulajdonsága IUPAC 1 enzimegység/ml (Ee/ml):
1 ml enzimoldat
1 mol termék képződését katalizálja 1 perc alatt
E + S ES E + T
ß-galaktozidáz
1.) Laktóz + H2O glükóz + galaktóz
-amiláz
2.) Keményítő + H2O n glükóz
ß-glükozidáz
3.) Cellobióz + H2O 2 glükóz
Enzim aktivitás meghatározásához definiálni kell a körülményeket:
Hogyan mérjük az enzimek mennyiségét?
SZUBTILIZIN: bakteriális proteáz, általános, nem specifikus enzim, a peptidkötés melletti oldalláncoktól függetlenül működik
TRIPSZIN: a hasnyálmirigyben termelődő tripszinogénből keletkezik, az emésztő enzimrendszer második tagja, csak akkor hasít, ha R1 : lizin, vagy arginin
TROMBIN : a vér alvasztó enzime, mely a vérplazmában oldott fibrinogént kocsonyás állapotú fibrinné alakítja és
ezáltal a vér alvadását idézi elő. A protrombinból keletkezik, s csak akkor hasít, ha: R1: arginin és R2 : glicin
Az enzimek specificitása nagyon különböző
Indukálható enzimek, pl. ß-galaktozidáz E. coliban glükózon 3 mol/sejt, laktózon 3000 mol/sejt. A laktóz induktor (inducer), olyan anyag, mely a táptalajba adagolva specifikusan megnöveli az illető enzim mennyiségét.
Represszálható enzimek, pl. E. coli aminosavmentes táptalajon szaporítva megtermeli az összes aminosav szintéziséhez szükséges enzimet. Ha a táptalajba pl. hisztidint adagolunk a hisztidin
szintetáz termelés megszűnik.
Konstitutív enzimszintézis, amikor a regulátor gén
működésképtelen represszort kódol, vagy nem is képződik
represszor fehérje, vagy nem tud kapcsolódni az operátorhoz és így nem tudja megakadályozni az átírást, s az enzim szintézis korlátozás nélkül folyik.
Fogalmak az enzimszintézissel kapcsolatban
Jól indukáljon
Ne fogyjon el a fermentáció alatt
Ne képződjön belőle olyan anyag, ami katabolit repressziót okozhat
Lehetőségek:
A szubsztrát ill. szénforrás maga (a gond, hogy elfogy)
Szubsztrát analóg pl. O S csere laktóz tiolaktóz, vagy kötésváltoztatás: cellobióz szoforóz (ß-1-4 ß-1-2 csere)
Kemosztát fermentáció
Az inducer folyamatosan képződik a fermentáció alatt, pl.
cellulózon történő szaporításkor a cellobióz
Az induktorral szembeni követelmények
Növényi (mg-i iparok: sörgyártásnál maláta)
Állati (oltóenzim)
Mikrobiológiai - egyre növekvő jelentőség (mg-i iparok:
szeszipar, keményítőipar)
Az enzimek ipari alkalmazásával egyidejűen szükséges volt az ipari léptékű enzimelőállítás megoldására is.
Az ipari enzimek eredete
Lényeges jellemzők a hozam (Ee/g szénforrás) és a produktivitás (Ee/l/óra)
Aerob
Anaerob
Szilárd fázisú
Félszilárd fázisú
Folyadék fázisú (süllyesztett)
Szakaszos (batch)
Rátáplálásos (fed-batch)
Folytonos
Enzimfermentáció fajtái
Intracelluláris
Extracelluláris
Az intracelluláris enzimkészítményeket felhasználhatják:
Sejthez kötve
Sejtből kivonva és elválasztva sejtmentes extraktként
Az extracelluláris enzimeket felhasználhatják:
A mikrobatömeg elválasztása után fermentlé felülúszóként
Sűrítményként (fermentlé felülúszó besűrítésével nyerik)
Kicsapással, vagy szárítással nyert szilárd enzim készítményként
Frakcionálás, tisztítás után nyert enzimkészítmény formájában
Az enzimtermelés lehet:
Enzimtisztítás, enzimfrakcionálás
Folyadékfázis tisztítása:
(extracelluláris enzimtermelésnél, vagy sejtfeltárás után a sejtek /sejttörmelék eltávolításakor nyert felülúszó):
-oldhatóság -tömeg/méret -töltés
-specifikus tulajdonságok alapján
Aspergillus phoenicis béta-glükozidáz termelése
• Táptalaj pH-ja határozza meg, hogy a szintetizálódott béta-glükozidáz megjelenik-e a fermentlében
extracelluláris béta-glükozidáz (teli) görbék különböző pH-kon (üres)
Prokariotáknál: (Baktériumok)
30 aminosavból álló hidrofób oldalláncokból álló lánc szintetizálódik és kötődik az enzimfehérjéhez (alanin, valin, leucin, prolin, fenilalanin,
triptofán, metionin)
ez a lánc viszi át a szintetizált enzimfehérjét a sejtmembránon
amikor az enzimfehérje kijutott a fermentlébe, s a lánc még a membránban van, leszakad róla, és újabb enzimfehérjét visz át a sejtmembránon
Eukariotáknál (élesztők, gombák)
eddig nem figyeltek meg a baktériumokéhoz hasonló szekréciós mechanizmust, a mikrobák autolízisével hozható összefüggésbe az
enzimek megjelenése a fermentlében. Adott mikroorganizmuson belül is nagyon különböző lehet ld. Aspergillus phoenicis ß-glükozidáz
kiválasztása: f (pH)
Szekréciós mechanizmus
táptalajösszetétel:
szénforrás (glükóz, hidrol, melasz, malátakivonat, tejsavó, metanol, cellulóz, szulfitszennylúg)
nitrogénforrás (NH4+, NO3-, karbamid, műtrágyák, kukoricalekvár, élesztőextrakt, pepton)
csapvíz+sók
habzásgátló
sterilezés
hőfokszabályozás
pH szabályozás
habszintszabályozás
habzás: keverős, levegőztetett - merülősugaras (HTPJ)
Enzimfermentáció
Cukortartalom
enzimaktivitás
pH
oldott oxigén (ökölszabály szerint aerob fermentáció esetén 30%-ot célszerű tartani)
Hozam (yield): Ee/g szénforrás Produktivitás: Ee/l/h
Mérendő faktorok a fermentáció során
különböző törzsgyűjteményekből (gond lehet, ha nem találunk
megfelelőt, vagy, ha a kiválasztott mikroba szabadalmi oltalom alatt áll)
izolálással:
talajból 106-107 mikroba/g
irányított szelekcióval:
- korhadó fáról-cellulózbontók, ligninhasznosítók (celluláztermelők, difenoloxidáztermelők)
- penészes kenyérről - amiloglükozidáz termelők
- keményítőüzem szennyvízéből: -amiláz termelőket
- hőforrásokból termotoleráns, vagy termofil mikroorganizmusokat lehetőleg nagy hőfok optimumú enzimekkel
A fermentációhoz szükséges mikroba beszerzése
• Komplett táptalajra
• Kiválasztott cél táptalajra (olyan körülményeket biztosítunk, amit szeretnénk majd használni)
• Ha csak kis koncentrációban van a keresett mikroorganizmus: DÚSÍTÁS
példa: Balatonfűzfői Nitrokémia szennyvízéből olyan mikrobát kellett izolálni, mely akrilnitrilhidratáz és amidáz aktivitással is rendelkezett
Dúsítás rázatott lombikokban: 0.008 g/l akrilnitril koncentráció mellett 0.5 g/l glükóz, pepton, foszfát, MgSO4 tartalmú táptalajjal helyettesítettük a dekantált felülúszót, naponta friss táptalajt adagoltunk.
akrilnitril koncentráció:
1 héten: 0.008 g/l 2.héten: 0.016 g/l
3.héten: 0.04 g/l, 1 hónap után a glükózt elhagytuk akrilnitril volt a kizárólagos szén és nitrogén forrás, további 2 hét szoktatás, majd azonos táptalaj agarral szilárdított változatára szélesztettük a tenyészetet
Leoltás - Dúsítás
Példa:Balatonfűzfőn a szennyvíziszapból nyert IK4 izolátum termelt:
Akrilnitril hidratázt és amidázt is, s olyan enzimkészítményre volt szükség, mely amidázt nem tartalmaz.
Akrilnitril akrilamid akrilsav
Mutációs kezelés (UV besugárzás) után szelekció olyan táptalajon, melyben az agarlemez fluoracetamidot is tartalmaz. Az amidáz+ telepek mellett képződő
fluorecetsav azonnal megöli az amidáz+ telepek mikrobáit, a túlélő telepek amidáz negatív mutánsok lesznek.
Nagyipari enzimfelhasználás: amiloglükozidáz, amennyiben az enzimkészítmény glükózoxidázzal, vagy transzglükozidázzal szennyezett, nem a fermentlé
frakcionálásával foglalkozunk, hanem az Aspergillus niger törzsjavításával, annak
Enzim tisztítási és elválasztási lehetőségek
Ahhoz, hogy az enzimek az iparban hasznosíthatóak legyenek, olyan termékek előállításában kell, hogy közreműködjenek, melyek a következő tulajdonságok valamelyikével rendelkeznek:
Jobb minőségű, mint a tradicionális termék
Jobban felhasználható
Olcsóbb
Enzimek nélkül nem is lehetne előállítani
Versenyképesség lényeges! Kristálycukor - izocukor 1970-es évek közepétől az izocukor versenyképes (amilázok árrobbanása)
Enzimek alkalmazása
25
Bár az enzimek enyhe reakciókörülményeket tesznek lehetővé, alkalmazásuknak vannak egyéb környezeti vonatkozásai:
• Előállításuk ipari fermentációban történik:
- Gyakran intenzív levegőztetésre van szüksége, és a kompresszorok sok villamosenergiát igényelnek
- C, N stb. forrás igény, melynek előállítása is energiát igényel Pl. a N-t nitrát só formájában adva gyakorlatilag műtrágya
felhasználást jelent, és a műtrágyagyártás is energiaigényes folyamat
• Rendszerszemlélet szükséges annak eldöntésére, hogy tényleg kisebb környezetterhelést jelent-e az enzimes technológia
• Életciklus elemzéssel vizsgálható
Enzimek alkalmazásának környezeti hatásai
Konklúzió: az enzimes technológiák – összehasonlítva a konvencionális megfelelőjükkel – kisebb mértékben járulnak hozzá az üvegházhatáshoz, az ökoszisztémák savasodásához, az eutrofizációhoz és a fotokémiai
ózonképződéshez
Enzimek alkalmazásának környezeti hatásai
• Oldott állapotban
• Rögzített (immobilizált) készítményként
Oldott enzimmel végzett katalízis:
amikor a termék koncentráció eléri a kívánt értéket, a reakciót leállítjuk, s a reakcióelegyet az igényeink szerint feldolgozzuk
kinyerjük a terméket
inaktiváljuk az enzimet
bekoncentráljuk a terméket
ha szükséges, továbbalakítjuk a terméket
Ebben az esetben többnyire nem használjuk fel újra az enzimet, habár vízoldható termék és szubsztrát esetén, amennyiben a termékmolekula és az
Az enzimek felhasználása
Definíció: rögzített enzimről beszélünk, ha az enzimmolekula fizikai módon elválasztható fázisban lesz a reakcióelegy többi részétől.
Lényeges különbség az oldott enzimmel végzett reakcióhoz képest, hogy a reakció végén az enzimet szűréssel, centrifugálással
(egyszerű mechanikai művelettel) el lehet választani a terméktől.
A TERMÉK tisztán (enzimmentesen) kinyerhető, az ENZIM pedig újrafelhasználható.
Rögzített enzimmel végzett katalízis
1960-as évek: csúcs az immobilizálásban, a laboratóriumi immobilizálásokkal foglalkozó tudományos cikkek száma több száz évente.
1969-ben megjelennek az első félüzemi berendezések, penicillin aciláz, glükóz izomeráz
1970-es évek: további méretnövelési kísérletek, ipari megvalósítás:
glükóz izomeráz,
ß-galaktozidáz, további félüzemek:
6-féle glükóz izomeráz,
2-féle penicilli naciláz,
aszpartáz,
aminoaciláz,
laktáz
1981: további félüzemek az előző enzimekkel, más-más eredet, más-más rögzítési mód
IPARI MEGVALÓSÍTÁS: továbbra is csak a glükóz izomeráz és a ß-galaktozidáz
Immobilizált enzimek története
A rögzített enzimek előnyei:
Egyszerű fizikai elválasztás után többször felhasználhatók
általában stabilabbak, mint az oldott enzimek
folytonos rendszerekben jól alkalmazhatók (immobilizált enzimekkel töltött reaktorok)
az enzim nem szennyezi a terméket, illetve nem kell külön gondoskodni az enzim elválasztásáról, vagy inaktiválásáról
Az immobilizált enzimek elterjedését limitáló faktorok:
az oldott enzimek kis ára (pl. A.niger eredetű amiloglükozidáz annyira olcsó, hogy nem lehet gazdaságosan immobilizálni)
a hordozó nagy ára
az immobilizált enzimeket felhasználó technológia bevezetéséhez
Rögzített enzimek: előnyök és hátrányok
A REAKCIÓ: a gazdaságos megvalósítás valóban csak immobilizált
enzimmel lehetséges-e? (pl. a kis szubsztrát koncentráció – 5%-os tejsavó – nagy oldott enzimveszteséget jelentene)
A SZUBSZTRÁT: vízoldható-e, eléggé kicsi-e a móltömege, nem várható-e erőteljes diffúziógátlás?
A TERMÉK: tisztább lesz-e ezáltal a termék, vagy olcsóbban tisztítható-e, nagyobb lesz-e a hozam?
AZ ENZIM: nő-e az enzim stabilitása a rögzítéssel? Gazdaságosabb lesz-e az enzimfelhasználás?
KONTROLL: jobbak-e így a szabályozási lehetőségek, automatizálható-e az eljárás?
GYÁR: kivitelezhető-e a technológia a meglévő létesítményben?
GAZDASÁGOSSÁG
Az immobilizált enzimek gyakorlati bevezetése előtt
vizsgálandó:
ENZIMELEKTRÓDOK-BIOSZENZOROK
glükózoxidáz: glükózmérés
alkoholdehidrogenáz: etanolmérés
ureáz: karbamid
HA AZ ELJÁRÁS GAZDASÁGOSSÁGA LEHETŐVÉ TESZI AZ OLDOTT---RÖGZíTETT CSERÉT
azonos tömegáram esetén kisebb gyárméret
kisebb terméktisztítási költségek
kisebb energiaköltségek
nagyobb produktivitás
Mikor használjunk rögzített enzimet?
Enzimaktivitás meghatározása:
Az aktivitásmérést az oldott enzimeknél elmondottak szerint kell elvégezni, azzal a módosítással, hogy a reakcióelegyet intenzíven keverni kell a diffúziógátlás
csökkentésére
Az aktivitás kifejezhető: Ee/g sza, Ee/g nedves tömeg, Ee/cm3 ágytérfogat
A rögzítés hatásfoka:
100 Ee-ből a rögzítés után mennyit tudunk meghatározni. 20-30%-os rögzítési hatásfok már jónak minősül.
Mi okozza az aktivitáscsökkenést?
1. A rögzítés során az enzim funkciós csoportjai reagálnak a hordozóval, vagy a keresztkötő ágenssel, s ezután ezek a csoportok már nem tudnak részt venni a katalízisben.
2. A rögzítés hatására sztérikus gátlások keletkeznek, s a szubsztrátmolekula nem fér
Immobilizált enzimekkel kapcsolatos fogalmak
Stabilitás
Miután az immobilizált enzimeket hosszú időn keresztül kívánjuk felhasználni, nagyon lényeges ismernünk a stabilitását.
A működési stabilitás (operational stability) két faktorból tevődik össze:
Az enzim kiáramlása következtében jelentkező aktivitáscsökkenés (enzyme leakage)
Hőinaktiválódás (fehérjék denaturálódásából fakadó aktivitásvesztés)
Az enzim kiáramlása azt jelenti, hogy a nem tökéletes rögzítés
következtében a szubsztrátterhelés, vagy egyszerű elúció következtében szabad (oldott) enzimmolekulák kerülnek a reakcióelegybe.
Immobilizált enzimekkel kapcsolatos fogalmak
Felezési idő
Az az időtartam (óra), ami alatt a kezdeti aktivitás a felére csökken le.
Óriási pazarlás lenne, ha az enzimeket csak a felezési időig használnák.
Két, három felezési időig szokták használni, de tudatában kell lennünk, hogy a térfogati produktivitás állandóan csökken.
Az állandó termékösszetétel és állandó kihozatal elérése érdekében ezt figyelembe kell vennünk.
Általában több (különböző fázisban levő) reaktort kapcsolnak össze.
Immobilizált enzimekkel kapcsolatos fogalmak
Produktivitás:
Az adott enzim 1 grammjával mennyi termék képződését lehet katalizálni g termék/g enzim
Térfogati produktivitás:
Adott ágytérfogat mennyi termék képződését katalizálja g termék/cm3 ágytérfogat
Diffúziógátlás:
Különösen akkor válhat jelentőssé, ha az enzimmolekulák nem a hordozó felületén, hanem a hordozó belsejében vannak rögzítve. Ekkor a
szubsztrátmolekulának az ENZIMHEZ, ill. a termékmolekulának az ENZIMTŐL való transzportjáért a rögzített készítményen belüli diffúzió a felelős.
Immobilizált enzimekkel kapcsolatos fogalmak
Az enzimek rögzítése
Kapcsolásos Bezárásos
adszorpciós ionos kovalens gélbezárás szálbazárás mikrokapszulába zárás monomerből kiindulva kész polimerbe zárva
nő a rögzítés erőssége nő a rögzítés költsége