1
Opponensi vélemény
Dr. Kálmán Bernadett: „A molekuláris genetika szerepe a sclerosis multiplex patogenesisének feltárásában” c. angol nyelven beadott MTA
Doktori Értekezéséről
A disszertáció összesen 147 oldal terjedelmű, 20 ábrát, 31 táblázatot, 74 tételből álló rövidítésjegyzéket, valamint 280 irodalmi hivatkozást tartalmaz, a formai előírásoknak megfelel. Az MTA Doktori Pályázatban ismertetett eredmények döntően az elmúlt 25 év USA-beli kutatásaiban születtek, ezekhez a kutatásokhoz a pályázó témavezetőként a disszertációban szereplő adatok alapján, kompetitív rendszerben kilenc, összesen közel kétmillió US dollár értékű kutatási pályázatot nyert el. A pályázat alapját 33, rangos nemzetközi folyóiratban megjelent közlemény képezi, melyből 32-ben a pályázó első vagy utolsó szerző. Mindezek hangsúlyozzák a témaválasztás időszerűségét és fontosságát: a sclerosis multiplex pathogenezise nem ismert, minden egyes új tényező felismerése döntően fiatal betegek sorsát változtathatná meg.
A disszertációban ismertetett vizsgálatok 2 szálon futnak: egyrészt a kemokinek szerepét vizsgálja gyulladásos demyelinisatióban, másrészt a mitokondriális molekulákra irányuló vizsgálatokkal a neurodegeneráció mechanizmusait elemzi sclerosis multiplexben. A gyulladásos folyamatokban a CCL gént, a neurodegeneratív folyamatokban pedig a légzési lánc 1. komplexének (Complex I) génjeit vizsgálták. Mindkét vizsgálatban biobankokból nyert nagyszámú mintán is végez méréseket (kemokin ligand: 1369 személy, mitokondriális vizsgálatok: 863 személy). Vizsgálati módszerként egymásra épülő, egyre pontosabb módszertant alkalmaz a kérdéses gének azonosítására: a gének kapcsoltságának („linkage”) elemzését a kapcsoltsági egyensúly eltolódásának mérésével („linkage dysequilibrium”) egészíti ki, majd harmadik lépésben a genotipusok meghatározására szekvenálást végez.
Az izolált DNS minták elemzése mellett számos egyéb módszert használ, pl. biobankból származó agyszöveten elemzi a plakkokat, valamint a normálisnak tűnő szerkezetű fehér- és szürkeállományi területeket, vizsgálja a cisztein-cisztein kötéssel rendelkező kemokineket, valamint a mitochondrium membránban lévő I. komplexet és annak termékeit, mRNS-t mér, monoklonalis antitestekkel immunhisztokémiai vizsgálatokat végez, stb. Az eredményeket a
„public domain” részeként hozzáférhető internetes adatbázisok tartalmával (humán genom projekt, HapMap projekt, Cambridge szekvencia) veti össze. Mindehhez többféle, részben egyedileg módosított szoftvert alkalmaz.
Vizsgálataival megállapította, hogy bizonyos kemokin ligandok szerepet játszanak a sclerosis multiplex kialakulásában. A kemokin ligandokkal kapcsolatos vizsgálataival a betegség hajlammal kapcsolatos új ismeretek születtek, melyek kiindulási alapját képezhetik egyénileg tervezett kis molekulákkal történő kezelési eljárásoknak. A vizsgálatok másik szálán
2
mitokondriális molekulák és mechanizmusok átfogó vizsgálatával többek által követett új kutatási irányt alakított ki. Megállapította, hogy a sclerosis multiplex, az optikus neuritis és a Devic betegség egyaránt kialakulhat patogén mitokondriális DNS mutációk nélkül is. A mitokondriális vizsgálatok eredményeképpen egy új sclerosis multiplex koncepció jött létre, mely a gyulladást mitokondriális mechanizmusokon keresztül kapcsolja a neurodegenerációhoz. Ezen vizsgálatok alapján a neuroprotektív terápiás beavatkozások egyik célpontja esetleg a mitokondrium lehet.
A disszertáció szerkezete világos, a bevezetést a kemokinek gyulladásos demyelinisatioban betöltött szerepével kapcsolatos vizsgálatok követik, majd a következő fejezet a mitokondriális genetikával és a neurodegeneráció mechanizmusaival foglalkozik. Végül az utolsó fejezetben a mitokondriumok neurodegenerációban játszott szerepét foglalja össze.
A disszertáció szerkesztésében sajátos, két fő fejezetben külön mutatja be a hátteret, a betegeket, módszereket és az eredményeket, illetve, hogy míg a citokinek vizsgálatával kapcsolatos fejezet következtetését a fejezet végén ismerteti, addig a mitokondriális vizsgálatokkal foglalkozó vizsgálatok következtetését külön fejezetben foglalja össze. A vizsgálatok komplex jellege miatt célszerű lett volna egy rövid, pontokba szedett összefoglalást megadni a disszertáció végén. A szöveg világos szerkesztésű, jól követhető. Az ábrák jellegűknél fogva komplexek, nagyon gyakran azonban a kisméretű betűk miatt nehezen olvashatók.
A disszertációban szereplő legfontosabb tudományos eredményeket a következőkben foglalhatjuk össze:
1.) Megállapította hogy a 17. kromoszóma hosszú karjának egy szakasza (17q11) által kódolt kemokinek egy része – CCL2, CCL3, CCL7, CCL8 - szerepet játszik a plakkok kialakulásában.
2.) A teljes mitokondriális genomot is felölelő vizsgálatok alapján igazolta, hogy mitokondriális genetikai mutációknak nincs szerepe a sclerosis multiplex, az opticus neuritis és a Devic betegség patogenesisében.
3.) Vizsgálataival felvetette, hogy a mitokondriális mechanizmusoknak szerepe lehet a gyulladás által elindított neurodegenerációs folyamatokban sclerosis multiplexben.
Megjegyzéseim és kérdéseim a következők:
1. A disszertációban számos szoftvert alkalmazott egy-egy genetikai kérdés vizsgálatára, pl.:
Pedcheck (22. oldal),
MERLIN (Multipoint Engine for Rapid Likelihood Inference (22 oldal),
3
TRANSMIT (23. oldal)
GOLD (24. oldal)
Perl script (26. oldal)
Roche analizis szoftver 4.0 verzió (29. oldal)
MEGA program módosított verziója (66 oldal) NJBOOTW.
Kérdésem: mennyire megbízható ezen – néha egyedi fejlesztésű - programok alkalmazása?
Amennyiben ugyanazon kérdés vizsgálatára ezek közül több is használható, mennyire egybevágóak az így nyert eredmények?
2. A jelölt a disszertációban számos website-on található tartalmat használ: pl:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)
http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/Merlin/
http://www.gene.cimr.cam.ac.uk/clayton/software/
http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/GOLD/docs/stats.html
http://genepi.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD/
http://www.hapmap.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=37544509&view=gbwithparts
www.mitomap.org
Kérdésem: mennyire megbízható ezen – jobbára mindenki számára hozzáférhető – adatbázisokban található információ? Az előző kérdéssel együtt: mennyire kiszolgáltatott a kutató, azaz mennyiben függ saját eredményeinek megbízhatósága az ilyen szoftverek és ilyen adatbázisok alkalmazása esetén?
3. Az agyminták több agybankból származtak (Rocky Mountain Multiple Sclerosis Brain Bank, Human Brain and Spinal Fluid Resource Center). Egyformák voltak-e ezekben az agybankokban a tárolás és a mintavétel körülményei? A különböző biobank forrásokból származó minták egyformának tekinthetők-e, vagy pedig a biobank forrásnak lehet szerepe a talált eltérésekben?
4. Mennyire befolyásolhatta az eredményeket az, hogy a biobankból nyert minták egy-egy betegből a sclerosis multiplex kórlefolyása során milyen fázisból származnak (pl. akut relapsus, szteroid kezelés előtti, szteroid kezelés utáni minta, interferon kezelés mellett nyert minta, stb.)?
5. Az agybankból nyert mintákban sclerosis multiplexes betegek nem érintett fehérállományi régiói (NAWN) is szerepelnek. Mennyire igazolható az, hogy ezek a minták valóban egészségesnek tekinthetők?
4
6. A 68. oldalon az agybankból szereplő minták között szerepel egy 18 éves eset is. Mi volt a halálok egy 18 éves sclerosis multiplexben szenvedő betegnél?
7. A kemokineknek jelentős szerepe van a gyulladásos folyamatokban, éppen ezért lenne fontos tudni, hogy pl. az agybankból származó minták esetén mi volt a minták forrásaként szolgáló betegeknél a halálok (pneumonia, sepsis, stb?).
8. Hogyan lehetne definiálni a „krónikus aktív plakk” kifejezést és mennyire elterjedt ennek alkalmazása? Miben különbözik ez az akut elváltozástól?
9. Mivel a disszertációban bemutatott eredmények közül számos statisztikailag szignifikáns eltérés a többszörös összehasonlítás után már nem érte el a statisztikai szignifikancia határát, kérdésem, hogy az elvégzett vizsgálatok közül - vonatkozzon ez a kemokin ligand vizsgálatokra, és a mitokondriális vizsgálatokra is - melyek azok a tényezők, amelyek egyértelműen, igazoltan, és statisztikailag szignifikáns mértékben is különbséget mutattak a sclerosis multiplexes betegek és az egészséges kontrollok között? Máshogyan fogalmazva a kérdést: talált-e a jelölt olyan eltérést sclerosis multiplexben, mely alapján vállalna prenatalis diagnosztikát?
10. A szerző által az optikus neuritis szokatlan formája, mely az optikus neuritis során tapasztalt akut látásvesztés nem javuló vagy progresszív formája az un. prominent opticus neuritis (PON) a klinikai gyakorlatban mennyire elterjedt kifejezés? Tekinthető-e ez a kórforma az optikus neuritis részeként, különös tekintettel a kórlefolyásra, illetve arra, hogy még rövidtávon sem reagál intravénás metilprednisolonra?
11. Az MR spektroszkópiával talált N-acetil aszpartát csökkenés és kolin emelkedés mennyire tekinthető specifikusnak sclerosis multiplexre? (55. oldal)
12. Az OND kontrollok egyéb neurológiai betegségeket jelentenek. Ezek a betegségek mennyire kezelhetők egy csoportként? (55. oldal).
13. A teljes mitokondriális DNS szekvencia analízisére használt 2. minta egy olyan betegtől származik, akinek betegsége 3 év alatt halálhoz vezetett, kognitív funkció zavarral, és epilepsziás rohamokkal járt, képalkotó eljárással általános atrophia igazolódott fokális károsodások nélkül. Ilyen klinikai kép mellett mennyire biztos a sclerosis multiplex diagnózisa a betegnél? (61. oldal)
14. A teljes mitokondriális vizsgálatra használt első beteg sem optimális jelölt, a családban autoszom domináns öröklődésű betegség fordult elő. Kérdésem, nem lehetett volna-e a mitokondriális teljes DNS szekvenciára a jelölt által alkalmazottnál tipikusabb sclerosis multiplex eseteket választani?
15. A sclerosis multiplex előfordulhat izolált formában, de családi halmozottság is jelentkezhet. Mit gondol a jelölt: a két kórkép ugyanaz a betegség-e?
5
16. Az adatelemzésben több helyen előfordul, hogy ugyanazon minták vizsgálatára paraméteres és nem paraméteres teszteket is alkalmaznak. Nem normál eloszlású minta esetén nem paraméteres tesztek alkalmazandók, mi magyarázza mégis a paraméteres és nem paraméteres tesztek felváltva történő használatát ugyanazon minta elemzésére?
17. A 76-77. oldalon sclerosis multiplexes betegek és kontrollok összehasonlításakor a másodlagos LHON mutációk előfordulásában egyoldalas khi-négyzet próbával a jelölt statisztikailag szignifikáns eredményt talált. A táblázatokban szereplő adatokkal ellenőrizve kétoldalas khi-négyzet próbában p = 0,27 illetve p = 0,072 értéket találtam.
Kérdésem, miért egyoldalas és nem kétoldalas tesztet alkalmazott a betegek és a kontrollok összehasonlításakor? Miért csak egy oldalas teszteket használ a statisztikai elemzések egy részében más helyeken is (pl. 99. oldal)?
18. A 77. oldalon egy patológiai esetre hivatkozva „primer progresszív sclerosis multiplex fulmináns kórlefolyással” diagnózis szerepel. Kaphatnánk-e több klinikai adatot erről az esetről, mert a primer progresszív sclerosis multiplexnek általában nem fulmináns lefolyása szokott lenn?
19. A 93. oldalon az I. Complex transmissioval kapcsolatosan az az állítás szerepel, hogy az egyéni összehasonlításokban enyhén szignifikáns különbségek mind elveszítették a szignifikanciájukat többszörös összehasonlítást követően. Kérdés, hogy mindezek alapján mennyire állíthatjuk, hogy egyértelműen igazolt, és mennyire állíthatjuk azt, hogy inkább csak valószínűsíthető a genetikai tényezők szerepe sclerosis multiplexben?
20. Érdemes lett volna a 12., 13., 14., ábrákra, valamint a a 17/a,b,c és d. ábrákra is standard error (SEM) helyett a standard deviációt (SD) megadni, vagy pedig az ábra feliratban az elemszámot (n) szerepeltetni, hogy az SD könnyen kiszámolható legyen. Mivel több alkalommal nem parametrikus tesztet alkalmazott a szerző, feltehető, hogy nem normál eloszlású mintákról van szó. Ha ez a helyzet, akkor az átlag és a SEM helyett célszerűbb lett volna a medián és az interquartilis range megadása.
Gépelési hibák:
A disszertációban gépelési hiba alig található:
15. oldal: Homo Sapiens áll Homo sapiens helyett
a 28. oldalon Herpes Simplex áll Herpes simplex helyett
74. oldal 5. sor: a sor végén egy „3”-as szám valószínűleg fölöslegesen szerepel.
A 12., 13., 14. ábrákon a függőleges tengely mértékegység lemaradt.
6
Az általam felvetett kérések nem vonják kétségbe a disszertáció tudományos érékét és következtetéseit.
A disszertáció alapján a doktori munka tudományos eredményeit elegendőnek tartom a doktori cím megszerzéséhez és a nyilvános védés kitűzését javaslom.
Budapest, 2011. november 15.
Dr. Bereczki Dániel
tanszékvezető egyetemi tanár
