Gének koordinált regulációjának két fő mechanizmusa baktériumokban

Gének koordinált regulációjának két fő mechanizmusa baktériumokban

A) operon: gének egy lókuszban, közös transzkript, közös regulátor policisztronos elrendezés

B) regulon: gének szétszórva a genomban, közös regulátor operon

regulon

A TRANSZKRIPCIÓS SZABÁLYOZÁS FŐBB GLOBÁLIS STRATÉGIÁI PROKARIÓTÁKBAN

inaktív aktivátor

inaktív

aktív aktivátor indukálószer

indukálószer represszor

inaktív represszor

derepresszált

KATABOLIKUS

derepresszált

aktív represszor indukálószer

represszált

BIOSZINTETIKUS

KATABOLIKUS

BIOSZINTETIKUS

indukált aktív aktivátor

inaktív inaktív aktivátor indukálószer

inaktív represszor

RNS polimeráz RNS polimeráz

represszált

negatív szabályozás pozitív szabályozás

indukciórepresszió

A transzkripciós faktorok és aDNS közötti specifikus kölcsönhatás

ún. Hélix-Turn-Hélix (HTH) motívumon megy keresztül

csgD: NNEIARSLFISENTVKTH LY merR: IGEVALLCDINPVTLRAWQR HTH Motívumok:

luxR: SWDISKILGCSERTVTFHLT

lehet a faktor N vagy C terminálisán,

a másik végen szokott lenni a ligand, kofaktor kötő régió

BAKTERIÁLIS TRANSZKRIPCIÓS FAKTOROK FŐBB CSALÁDJAI

AraC család AraC, MelR, RhaS, RhaR, SoxS

LysR család LysR, OxyR, MetR, CysB

Crp család Crp, Fnr

MerR család SoxR

Két komponensű NarL, OmpR, Arc szabályozó család

Lac represszor család LacI, GalR

MetJ család MetJ

Faktor család Tagok

Aktiváció a gén expresszióban I.

Aktiváció a gén expresszióban I.

Kölcsönhatás:

-  CTD-nel (CRP)

- 

4-es régiójával (  cI aktivátor) -  NTD-nel (CRP)

-  alegységgel (DnaA) -  ’ alegységgel

(N4 single-stranded DNA kötő fehérje)

-  CTD-nel és 

4-es régiójával (FNR)

Positive activation of gene expression Virgil A Rhodius, Stephen JW Busby

Current Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159.

Positive activation of gene expression

Aktiváció a gén expresszióban II.

Aktiváció a gén expresszióban II.

Promóter konformáció megváltoztatása:

- “-35” és “-10” régió azonos oldalra kerül (MerR, SoxR)

- DNS visszahajlik és az aktiváló cis szekvencia RNAP fölé kerül

- DNS konformáció változást indukál

(FIS, IHF)

DNS-hajlító fehérje (pl. IHF)

Specifius kötőhely

Távoli aktivátor helyek segítséget igényelnek

Aktiváció a gén expresszióban III.

Aktiváció a gén expresszióban III.

2 aktivátortól függő promóterek:

- az aktivátor kötődése egy másik aktivátortól függ (eukarióta)

- aktivátor kötődése egy másik aktivátor áthelyeződését eredményezi

(CRP-MalT a malK promóteren) - független aktiváció

(⁷⁰ vagy NTD és CTD)

- represszor müködését gátolja (FIS-NARL/P-FNR)

Positive activation of gene expression

Transzkripció repressziója baktériumokban

FNR FNR

- fumarát nitrát reduktáz regulátor - citoplazmatikus szenzor-regulátor - dimer[4Fe-4S]²⁺ DNS-t köt

- monomer[2Fe-2S]²⁺ inaktív

- aenaerob respirációra (+) vagy (-) hatás - pO₂ 1 mbar alatt

- TTGAT-N₄-ATCAA konszenzus szekvencia - [2Fe-2S]²⁺  [4Fe-4S]²⁺ (in vitro)

Cys, Fe, DTT, NifS

- Pseudomonas: ANR; Bacillus: FNR Rhodobacter sphaeroides: FnrL

O

FNR_red FNR_ox

Komponensek

- egy szenzor kináz és egy DNS kötő regulátor - E. coli genom 2%

- kb 50 különböző 2 komponensű rendszer - 3 alcsalád: OmpR, FixJ és NtrC

Két komponensű szabályozó rendszerek

P

szenzor kináz fehérje

DNS kötő fehérje

P

Érzékelő Foszforilációs

Érzékelő Foszforilációs Érzékelő Foszforilációs

Felvevő DNS kötő

Felvevő DNS kötő

szignál

transzfoszforiláció

DNS DNS

A bakteriális kétkomponensű szabályozó rendszerek

működése elve

- OmpR ( E. coli ):

porin szerveződés szabályozása ozmózis változás hatására - általában 

használó transzkripciót aktivál

- kölcsönhatás az RNS polimeráz  alegységének C terminálisával - ha az N terminális foszforilálódik megszünik a gátló hatása a C terminális DNS kötő domén felé

OmpR

- általában 

használó transzkripciót aktivál

- receiver domén deléciója esetén aktív transzkripció lesz

FixJ

NtrC

- N terminális receiver és C terminális DNS kötő domén között egy központi ATPáz domén (glicin gazdag “Walker box”)

- DNS kötő domén FIS-hez homológ

(FIS: eukarióta enhancer kötő fehérje)

- általában 

használó transzkripciót aktivál

ArcA/B ArcA/B

- aerobic respiratory control

- ArcB (szenzor kináz): sejt redox és metabolikus helyzet (elektron transzport változást érzékel)

- ArcA(citoplazmatikus regulátor): ArcB foszforilálja  aktív - pO₂ 1-5 mbar között

- TATTTaa konszenzus szekvencia

- Haemophilus: ArcA

- E. coli homológ gén: OmpR

O

P

ArcB P

ArcAP

ArcA

ArcA ArcB

oxigén mentes környezet

FNR

P

Az ArcAB és FNR anaerob aktivációja

NarX/L és NarP/Q NarX/L és NarP/Q

- nitrát regulator

- NarX és NarQ: membrán szenzor kináz - NarL és NarP: citoplazmatikus regulátor - szignál: nitrát és nitrit

- nitrát metabolizmusra hat

- NarL és NarP különböző génekre különböző atás  a génexpresszió finom hangolása

NO

NarPP NarX

NarQ

NarLP

P

Kétkomponensű rendszerek vége

A lac operon kettős szabályozása

 laktóz (allolaktóz) indukál

 glükóz gátol, cAMP/CAP-n keresztül

 glükóz/egyéb cukor

kiiktatása tápból nem célszerű

  glükóz szabályozás kikapcsolása

trp

AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCA tac

AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA lacUV5

CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGA lac

CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGGTGTGTGGA

“-35” “-10”

lac (és trp ) alapú promóterek

lac UV5  lac promóter UV

erősség

A transzkripciós faktorok sokoldalúak….

Ara C

-Ara P^BAD represszió +Ara P^BAD indukció

RNS polimeráz

P_BAD

AraC

AraC

P_BAD

a) hurok képződés indul

b) hurok képződés indul hibrid destabilizálódik

c) termináció

a) Rho kötődik és üldözi a polimerázt

b) hurok képződés, polimeráz megáll

c) Rho helikáz felszabadítja a transzkriptet, termináció

Transzkripció termináció baktériumokban

Rho független Rho függő

A transzkripció és a transzláció párhuzamosan

megy baktériumokban

protein antranilát szintáz indol-glicerin szintáz triptofán szintáz

A triptofán operon szerkezete

A triptofán operon szabályozása

Termináció – attenuáció – trp operon

Termináció - antitermináció

túl sokat nem

lehet vele kezdeni, génen belüli sajátság

E. coli -ban fehérje túltermeltetésre használt promóterek

mRNS degradáció baktériumokban

mRNS stabilitás

prokariótákban néhány perc, eukariótákban órás nagyságrend  előbb utóbb minden RNS lebomlik

 mRNS stabilitását meghatározó faktorok:

- belső, saját szerkezet

- a környezet hatására bekövetkezett változás a degradációs apparátusban

puf operon (a fotoszintetikus komplex komponensei)

Rhodobacter capsulatus degradációja O₂ hatására felgyorsul

policisztronos rendszerek esetén az alegységek arányának szabályozása a mRNS régióinak eltérő stabilitásával

A R. capsulatus puf mRNS régióinak stabilitása

 - transzkripció gátlása (pl. rifampicin) t=0 időpontban,

majd  időközönként mintavétel és RNS analízis (Northern..) - a degradációs mechanizmusban szerepet játszó gének deléciója,

hőmérséklet érzékeny expressziós változatának kialakítása - in vitro transzkripció jelölt nukleotidokkal,

a kapott termék inkubációja a sejtextraktummal különböző ideig, majd analízis gélelektroforézissel,

kvantitálás

mRNS degradáció baktériumokban,

vizsgálati módszerek

Bacterial exoribonucleases Polynucleotide phosphorylase Ribonuclease PH

Ribonuclease II Ribonuclease R RNase D

Ribonuclease T Ribonuclease BN Oligoribonuclease

Bacterial endoribonucleases Ribonuclease I

Ribonuclease III Ribonuclease P Ribonuclease E Ribonuclease HI

A degradáció iránya virtuálisan 5'  3' irányú,

de ilyen enzimaktivitást nem lehet kimutatni prokariótákban Megoldás: kombinált enzimműködés  degradoszóma

RNázok, RNS degradáció

mRNS-t stabilizáló-destabilizáló tényezők

Az 5’ végi struktúra stabilizáló hatása

a stabillizálódás a mRNS hurok struktúrájában van

nem a riboszóma véd,

a stabilizáló effektus átvihető más génekre

mRNS-eket stabilizáló (védő) tényezők

1. 5’ végi trifoszfát

2. RNS struktúra

3. riboszóma

A degradoszóma felépítése

Az RNaseE elsődleges felépítése

A degradoszóma komponensei I.

Endoribonuclease E (RNáz E)

1061 aminosav  118 kDa fehérje, virtuálisan 180 kDa (oka prolin gazdag régió)

felismerő hely:

(A/G)AUU(A/T)

vagy egy komplex másodlagos struktúra

5' monofoszfátot preferál 5' trifoszfát stabilizál

N-terminális régió (50 kDa) hasonlít a Caf-re (cytoplasmic axial filament protein)

 feltételezett funkció a belső RNS transzportban

N terminális 70 aa (S1 domén) hasonlít a PNPase és RnaseII

(illetve (CSP, cold shock protein, RNS chaperon) RNS kötő doménjére C-terminális

a degradoszóma egyéb komponenseire megfelelő kötő domének

A degradoszóma komponensei II.

PNPase (polynucleotide phosphorylase)

 78 kDa alegységek, homotrimer

 3'  5' foszfát függő processzív exonukleáz,

 ribonukleotid difoszfátok képződnek

 poliadenilációs aktivitás

Polyphosphate Kinase (PPK)

 funkció: ATP regeneráció,

polifoszfát (inhibiálja a degradációt) eltávolítás

 ppk mínusz törzs : megnövekedett mRNS stabilitás

 80 kDa alegységek, homotetramer, sok van E. coli-ban

A degradoszóma komponensei III.

Helikáz

ATP függő DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) helikáz

50 kDa RhlB

a másodlagos struktúrák kinyitása szétroncsolása

ATP hiányában a hurokstruktúra

stabil marad

Egyéb – mRNS degradációjában résztvevő – enzimek RNáz II

70 kDa monomer,

a sejt 3'  5' exoribonukláz aktivitásának 90%-a

ribonukleotid monofoszfátok képződnek

a PNPáz-zal együttes deléciója letális !!!

PolyA polimerázok

PAPI 53 kDa

PAPII 35 kDa

 poliadeniláció, 15- 50 bázis hosszú

 mRNS instabilitás

A mRNS degradáció mechanizmusa