Vizsgálati lehetőségek

Számos DNS-hez kötődő molekula kiterjedt delokalizált π-elektronrendszerrel rendelkezik, így számottevő fényabszorpciót mutatnak az UV és a látható fény hullámhossztartományában. Ez lehetőséget teremt a folyamatok optikai spektroszkópiai követésére. Spektroszkópiai vizsgálatok során a molekulák esetleges aggregációja, a többféle kötőhely spektrális jellemzőinek elkülönítése, és a kötődés optikai tulajdonságainak koncentrációval történő változásai azok a körülmények, amelyek kihívást jelenthetnek kiértékelés során (79).

Bár az abszorpciós spektroszkópia egy egyszerű, napjainkban mindinkább háttérbe szoruló spektroszkópiai módszer, megfelelő kísérleti körülmények között a DNS-kötődési folyamatok során mégis előnyös lehet a használata. Ismeretes, hogy az interkaláció kialakulása általában a spektrum vörös irányú eltolódását eredményezi,

GnRH III

Spacer

19

hiszen a nukleinsav bázisok és a kromofór elektronrendszere ilyenkor igen közeli kontaktusba kerülnek (6,9). A külső kötődést kevésbé határozott eltolódás jellemzi, azonban van lehetőség arra, hogy a spektrum alapos elemzése során a két kötési forma hozzájárulását a teljes spektrumhoz elkülönítsük egymástól (11, 15, 79).

A fluoreszcencia spektroszkópiai módszereknek, a gerjesztési és emissziós színképek felvételének haszna a nagyobb specificitásban nyilvánul meg. Adott hullámhosszúságú gerjesztő fény hatására kibocsátott fluoreszcencia jellemzői, a hullámhossz és az intenzitás, a kérdéses anyagra nézve egyediebbek az elnyelési színkép paramétereinél, így lehetőség nyílhat komplexebb rendszerekben is a kiértékelés elvégzésére. A fluoreszcencia spektrum szintén változik kötődés létrejötte nyomán (80,81). Daunorubicin és származékai esetében ez lehetőséget teremt kötődési állandók számítására (82).

A fluoreszcencia időbeli lecsengése is fontos mérendő paraméter lehet - különösen a porfirinek esetében - és az egyes kötött formák jelenlétének kimutatására használható, hiszen DNS-sel való kölcsönhatás következtében a fluoreszcencia élettartama is változáson megy át (80).

A lumineszcencián alapuló eljárások további válfaja az energiatranszfer vizsgálata, ekkor a gerjesztést az UV-C tartományban, vagyis a DNS abszorpciós sávjában végezzük, miközben a kötődő molekula színképének változását figyeljük meg. Kötődés létrejöttét mutatja, ha a vizsgált molekula fluoreszcencia kvantumhatásfoka megnő DNS jelenlétében. A DNS-től a kötődő molekulák felé megvalósuló energiatranszfer kialakulásához a nukleinsav bázisok és a ligandum elektron-rendszerének közeli kapcsolatára van szükség, ezért a jelenséget leginkább interkalációval kötődő molekulák esetében figyelték meg (10, 83).

Alkalmazható a kromofórok optikai aktivitását vizsgáló spektroszkópia is, a cirkuláris dikroizmus. Egyes anyagok a síkban polarizált fény két, ellentétes irányba forgó komponensére nézve eltérő törésmutatót és extinkciós koefficienst mutatnak, ennek következtében az eredetileg lineárisan poláros fény áthaladás közben elliptikusan polárossá válik. Az ellipticitás mértéke a két gyengítési együttható különbségéből adódik, és hullámhossztól való függésének vizsgálata értékes anyagszerkezeti megállapításokra ad lehetőséget. Porfirin-DNS rendszerek elemzésekor kihasználható a kötődés kimutatására az, hogy az önmagukban

20

optikailag inaktív porfirinek a DNS-spirálhoz kötődve optikai aktivitásra tesznek szert, tehát az indukált cirkuláris dikroizmus jelenségét mutatják. A mérések legtöbb esetben a kötési formák elkülönítésére is alkalmat adnak (10, 84-86). CD spektrometria segítségével a DNS és nukleoprotein komplexek szerkezetváltozása is követhető válik a kötődési folyamatok során, mely további értékes információt jelent.

Indukált optikai aktivitást felhasználó eljárás még a lineáris dikroizmus is, mely segítségével az abszorbeáló elektronrendszer és a nukleinsav makromolekulák tengelyének szöge határozható meg (87).

A vizsgáló módszerek némileg külön szegmensét jelentik az optikai olvadási görbék („melting”) felvétele. Melting vizsgálatok során a DNS abszorpciójának vizsgálatára kerül sor a hőmérséklet függvényében. A DNS fényelnyelése λ=260 nm-en megnő a kettős hélix szétválása következtébnm-en, tehát a módszer pontosan meghatározhatóvá teszi a denaturáció hőmérsékletét. Ehhez az abszorbancia vagy az extinkciós együttható változását az idő függvényében ábrázoló derivált olvadási görbe elemzésére van szükség. A denaturáció hőmérséklete megváltozhat a különböző kötődő molekulák hatására, még pedig annak függvényében, hogy az egy- vagy kétszálú DNS iránt mutatnak nagyobb affinitást. Ha a ligandum a kétszálú DNS-hez kötődik jelentősebb mértékben, akkor a stabilizáció következtében nő a polinukleotid denaturációjának hőmérséklete, míg ha az egyszálú DNS segíti elő jobban a kötődést, akkor a denaturációs hőmérséklet értelemszerűen csökken.

Nukleoprotein komplexek vizsgálata során lehetőség nyílik a fehérjék denaturációjának megfigyelésére is, ezáltal jelezheti a hatóanyag-fehérje kölcsönhatásokat (88, 89).

Különböző kalorimetriás módszerek is alkalmazhatók nukleinsavakhoz történő kötődés vizsgálatára, meghatározható a reakció során felszabadult vagy elnyelődött hőmennyiség, termodinamikai összefüggések alapján kötődési állandók kerülhetnek meghatározásra (90).

A vizsgálatok külön csoportját képzik a röntgen-krisztallográfiás mérések és a molekuláris modellezés. Röntgen-krisztallográfiával oligonukleotid-ligandum komplexek térszerkezete, az egyes atomok relatív helyzete és egymáshoz viszonyított távolsága határozható meg. A módszer jelentős hátránya azonban, hogy csak a megfelelő méretű és minőségű kristály alkalmazható a mérés során, így

21

csupán speciális körülmények közt érvényes megállapítások tehetők a kötődést illetően. Születtek eredmények porfirin-DNS komplexek térszerkezetének leírását célozó kísérletek alkalmával, amelyek oligonukleotidok és TMPP-fémkomplexek kötődését elemezték. Megállapították az interkaláció és a külső kötődés térbeli viszonyait, továbbá a nukleotid-láncra gyakorolt hatásukat: interkaláció során jelentős konformációváltozás tapasztalható, nukleinsav bázisok láncon kívülre szorulásával és a hélix csavarodási szögének megváltozásával, míg a külső komplex során a porfirin hidat képez a kisárokban, és csak kisebb mértékű torzulást okoz az oligonukleotid szerkezetében (91, 92).

Molekuláris modellezéssel szintúgy oligonukleotidok és ligandum kötődésének elméleti analízisére nyílik lehetőség. Kezdeti feltételezésekből kiindulva megkísérelhető egy hipotetikus molekula-komplex viszonyainak leírása. Azonban a módszer határait jelenti, hogy nehézségek adódhatnak nagyobb nukleinsav láncok, komplexebb rendszerek esetén számítási korlátokból következően. Az eddigi modellezési eredmények a porfirinek esetében a kétféle kötési forma jelenlétét, továbbá az ezek esetében kimutatott bázispreferenciát és a kötődés formáinak elméleti energetikai leírását adják meg (93-96).

Végezetül említésre méltó még a molekuláris biológiai eljárások alkalmazása a kölcsönhatás vizsgálatára. Ilyen módszer a DNS-hasításán alapuló „footprinting” és az affinitáson alapuló lánchasítás. Footprinting során egy ismert hasító anyag DNS-degradációs hatásának megváltozása kerül elemzésre nukleinsavakhoz kötődő molekulák jelenlétében. A DNS hasítását általában methidium-propil-EDTA, KMnO4, DNáz I ágensek egyikének adagolásával végzik, a fragmentumok elkülönítésére elektroforézist alkalmaznak (95, 97). Affinitáson alapuló lánchasítás során pedig magának a ligandumnak a hasítási képességéből vonhatók le következtetések a molekula kötőhelyeiről és a szekvencia-specificitásról. Ismert például, hogy a TMPyP mangán komplexe rendelkezik DNS hasító képességgel (98).

22