Turbulens áramlású kromatográfia (Turbulent Flow Chromatography: TFC)

Az elızı fejezetben bemutatott technikák alkalmazásával a mintaelıkészítés lényegesen egyszerősíthetı, kevesebb hibaforrás található a folyamatokban, azonban az áteresztıképesség növelésének ellenére még mindig viszonylag hosszú analízisidıkkel kell számolni, ami leginkább a hosszú extrakciós idıkbıl adódik. HS-SPME esetén pl. meg kell várni, míg beáll az egyensúly a minta és a gázfázis között, majd ezt követıen történik az adszorpció, végül pedig a deszorpció a GC-készülék injektorában, így akár 30 percet is meghaladó ideig is tarthat egy mérés a mintavételtıl a mérés végéig. Egy nagyon jó alternatíva a mérési idık csökkentésére az 1997-ben bevezetett turbulens áramlású kromatográfia alkalmazása.

A TFC lehetıvé teszi komplex biológiai minták közvetlen injektálását, különféle mintaelıkészítési eljárások alkalmazása nélkül. A technika alapja, hogy egy arra alkalmas kolonnán elválnak egymástól a kismérető meghatározandó és biológiai mátrix nagymérető molekulái, a makromolekulák (proteinek) nagy diffúziós koefficiense következtében. Ez a nagymértékő elválasztási hatékonyság a kolonnában kialakuló turbulencia eredménye, amely a mobil fázisban keletkezı örvények miatt megnöveli az anyagtranszport sebességét. Az örvények keletkezése végeredményben egy dugószerő áramlási profilt hoz létre, csökkentve a sávszélesedést, ellentétben a klasszikus lamináris áramlási profillal. A töltött kolonnákban kialakuló turbulens áramlás függ a szemcsemérettıl, valamint a mozgófázis lineáris áramlási sebességétıl és fizikai-kémiai tulajdonságaitól. Rövid, viszonylag vastag, nagy szemcsemérető kolonnák (általában: 500 x 1 mm, 50-60 µm) szükségesek a turbulens áramlás kialakulásához, valamint olyan pumpák, melyek képesek ennek a fenntartására. Az alkalmazott áramlási sebesség általában 4-5 ml/perc. Az extrakciós oszlopon visszatartott vizsgálandó anyagokat a szerves mozgófázis egy oszlopváltó szelep segítségével juttatja az analitikai oszlopra, ahol megtörténik az elválasztás, majd pedig a detektálás. A TFC-nak különbözı technikai megvalósításai vannak (32. ábra). Így megkülönböztetünk egy oszlopos egy szelepes, két oszlopos egy szelepes, illetve kétszelepes megoldásokat egyaránt, valamint egy (32. ábra felsı panel, folytonos vonallal jelölt) illetve két pumpát (32. ábra felsı panel,

szaggatott vonallal jelölt) használó megvalósításokat. Az egykolonnás esetben mind a tisztítás, mind pedig az elválasztás a TFC kolonnán történik. Ennek az alapja, hogy a TFC kolonnának, bár jelentısen különböznek az analitikai kolonnáktól, van elválasztási képessége is.

mintafelvitel és tisztítás elúció

32. ábra: egy szelepes, egy- illetve kétkolonnás TFC konfigurációk P: pumpa; D: detektor; H: hulladékoldószer tároló

A tisztítás során turbulens körülmények között történik a minta felvitele, majd miután a nemkívánatos komponensek elhagyták a kolonnát egy váltó szelep segítségével a mozgófázis áramlási irányát megváltoztatják és a vizsgálandó anyagot így juttatják a detektorba. Mivel a TFC kolonna elválasztási hatékonysága jelentısen kisebb egy analitikai kolonnáénál, ezért ezt a megoldást leginkább egy vagy néhány meghatározandó komponens esetében célszerő

TFC-oszlop

alkalmazni. A másik probléma, hogy a turbulens áramlás körülményeit (4-5 ml/perc áramlási sebesség) a leggyakrabban detektorként alkalmazott tömegspektrométerek nem képesek kezelni, ezért szükség van az eluensáram elosztására, ami csökkenti a kimutathatóságot. A kisebb érzékenység nem az MS készülékbıl eredı probléma, hanem az eluensáram elosztása következtében a MS-be bejutatott vizsgálandó anyag koncentrációjának jelentıs lecsökkenése okozza. Erre a problémára jelenthet megoldást egy másik pumpa alkalmazása (32. ábra felsı panel, szaggatott vonallal jelölve). Ebben az esetben a minta injektálása, illetve tisztítása turbulens körülmények között történik, míg az elúció egy másik pumpa alkalmazásával már alacsonyabb áramlási sebességgel. A másik pumpa alkalmazásának további elınye, hogy az alapvetıen vizes alapú TFC körülményeket megfelelı oldószerre lehet cserélni. Az egy oszlopos megvalósítás esetében a TFC oszlop alacsony tányérszáma és a nagy szemcseméret miatt, nagymértékben kiszélesedett és „tailing”-es csúcsokat detektálhatunk. ennek kiküszöbölésére kiválóan alkalmas a kétkolonnás megvalósítás (32. ábra alsó panel), ahol egy hagyományos HPLC oszlopot építenek a rendszerbe, lehetıvé téve egy megfelelı analitikai elválasztást. A mintát a TFC oszlopról olyan eluenssel juttatják az analitikai kolonnára, mely alkalmas a TFC oszlopról való eluálásra, de nem elég erıs az analitikai kolonnáról történı elúcióhoz, így a minta az analitikai kolonna elején összegyőlik, majd a megfelelı oldószerre történı váltás után megtörténik az elválasztás és a detektálás. A hatékonyság növelése érdekében további technikai megvalósításokat is (izokratikus fókuszálás, továbbfejlesztett izokratikus fókuszálás) használnak. A TFC alkalmazása egyre nagyobb mértékő, leginkább farmakokinetikai, ADME, metabolizmus vizsgálatokban, metabolitok azonosításában alkalmazzák.

Ahogyan az már említésre került, az analitikai mérések egyik, ha nem a legkritikusabb pontja a mintaelıkészítés. A megfelelı technika kiválasztásánál figyelembe kell venni többek között az idıt, a szelektivitást, a lépések számát, az oldószer-felhasználást, valamint az on-line kapcsolás lehetıségét egyaránt. A bioanalitikai vizsgálatokban, valamint a labordiagnosztikában jelenleg legelterjedtebben a SPE-t használják, de egyre jobban teret hódítanak a különbözı mikroextrakciós technikák és egyéb eljárások is. Az 4. táblázatban összefoglalt technikákon kívül természetesen egyéb lehetıségek is vannak, azonban a jegyzet keretei nem teszik lehetıvé minden módszer ismertetését, illetve a bemutatásra került tecnikák részletekbe menı leírását. Akik további illetve részletes információt kívánnak szerzni errıl a tudományterületrıl, azoknak ajánlom Janusz Pawliszyn és Heather L. Lord

szerkesztésében Handbook of Sample Preparation, valamint Roger M. Smith szerkesztésével megjelent Bioanalytical Separtions címő könyveket.

4. táblázat: a bemutatott mintaelıkészítési technikák összehasonlítása megnevezés extrakció

ideje (perc)

szelektivitás többlépéses folyamat oldószerigény

ASE (PLE) 10-15 közepes - kicsi

MAE 5-15 közepes extrakció/szőrés kicsi

SFE 5-15 közepes - kicsi

LLE 15-20 közepes + nagy

SPE 15-25 közepes + kicsi

SPME 10-60 közepes adszorpció/deszorpció nincs

LPME 10-60 közepes + nagyon kicsi

MEPS 1-5 közepes + nagyon kicsi

MIPs 15-20 nagy + kicsi

TFC <5 közepes - nincs?