TRAUMÁS AGYKÁROSODÁS
Amiloid prekurzor protein (APP) – az axonális károsodás fontos markere
Az amiloid kaszkád lényeges korai folyamata az inszolúbilis, potenciálisan neurotoxikus béta‐amiloid képződése az amiloid prekurzor fehérjéből (APP). Az APP a központi idegrendszerben bőségesen előforduló (ubikviter) fehérje, mely a sejtmembrán glikoproteinjeként fontos szerepet játszik a sejtadhézióban, neuroprotektív hatású és axonális transzport révén a szinapszisba jutva ott is lényeges modulátor szerepet játszik. A neuroprotektív hatása a szekretált, és a sejt környezetébe bocsátott N‐
terminális fehérje fragmensek révén valósul meg leginkább. A fehérje a 21‐es kromoszómán kódolt és alternatív fehérje hasítás (splicing) és proteolitikus processzálás után 3 fő altípusa ismeretes. Az axonális transzport jellegzetesen gyors anterográd mozgását (pontosabban aktív transzportját) jelenti a fehérjének. Ez magyarázza, hogy axonális károsodás esetén a károsodástól proximálisan a fehérje felhalmozódik. Ez az alapja annak, hogy az axonális károsodás immunhisztokémiai detektálására alkalmas. Az APP kóros lebomlása az ún. amiloidogén protelolitikus útvonal révén az Alzheimer‐kórra jellegzetes béta‐amiloidot eredményezi, mely plakkokban lerakódva az Alzheimer‐kór talán legjellegzetesebb morfológiai szubsztrátuma. Fiziológiás körülmények között az axonokban élettanilag transzportálódó APP mennyisége olyan csekély, hogy immunhisztokémiailag nem detektálható. Axonális károsodás kapcsán azonban (mint fentebb írtuk) fölhalmozódik.
Noha ez a fölhalmozódás nem specifikus az axonális károsodás etiológiájára vonatkozóan, a traumás agykárosodás kapcsán kialakuló APP felhalmozódás,
mintázata jellegzetesen elkülönül a például iszkémiás behatás kapcsán kialakuló axonális károsodás mintázatától.
Az APP (többek között) a neurodegeneratív kórképek kialakulásában játszott szerepe miatt került érdeklődésünk előterébe az elmúlt évtized második felében. Ekkor jelentős számú forenzikus neuropatológiai esetet is láttam neuropatológusként, ahol gyakran felmerült a kérdés, az elhunyt szenvedett‐e trauma kapcsán vagy esetleg attól függetlenül kialakuló axonális károsodást, és ha igen, ennek mértéke alapján lehet‐e következtetni arra, hogy a trauma és a halál ok‐okozati kapcsolatban állt; ha igen, akkor ez milyen mértékű (azaz a trauma közvetlen és egyedüli haláloknak tartható‐e). A többségében fiatal elhunytakat verekedés, autóbaleset, magasból leesés vagy egyéb okból szenvedtek sérülést és később meghaltak. A bíróság számára mindig fontos kérdés, hogy a vallomások illetve videofelvételek alapján bekövetkezett trauma okozta‐e a súlyos fokú agysérülést vagy az egy esetleg korábban bekövetkező trauma késői következménye (ennek lehetőségét általában a védelem kéri tisztázni bírósági ügyekben).
Vizsgálatainkban arra kerestünk választ, hogy mi az a legkorábbi időpont, amikor traumás eredetű diffúz axonális károsodás APP immunhisztokémiával kimutatható (Hortobágyi és mtsai, 2007). A korábbi adatok két órát jelöltek meg (Blumbergs és mtsai, 1995) de az APP transzportjának sebességét és egyéb élettani, ill. kórélettani szempontokat figyelembe véve feltételezhetőnek tartottuk, hogy ez már korábbi időben is kimutatható lehet. Ezért traumás esetekből 3 csoportot hoztunk létre: 30 percnél rövidebb túlélés, 35‐60 perc közötti túlélés, valamint 45‐109 perc közötti túlélés olyan traumás esetekben, ahol diffúz axonális károsodás illetve trauma kapcsán kialakuló halál kizártnak tartható. Vizsgálataink során fontos aspektus volt az immunhisztokémiai módszer optimalizálása, az antigén előhívó módszerek kipróbálása, az antitestek tesztelése. Eredményeinket, a módszereket
közleményünkben foglaltuk össze (Hortobágyi és mtsai, 2007). Megállapítottuk, hogy minimun 35 perces túlélés szükséges (és elégséges) olyan mértékű APP felhalmozódásra a sérült axonokban, ami rutin gyakorlatban is használható immunhisztokémiai módszerekkel detektálható (15. ábra). Közleményünk fontos hivatkozási alap azóta is bírósági tárgyalásokon. Egy másik közleményünkben (Hortobágyi és mtsai, 2008) foglaltuk össze a diffúz axonális károsodás jelentőségét
valamint azt, hogy hogyan lehet ezt diagnosztizálni, miként kell értékelni. Ezen közleményünkben kitértünk az ún. „Shaken baby syndrome”‐ra, mely terminológia helyett ma már „non‐accidentalis károsodás” fogalmat használják.
15. ábra. Korai traumás axonális károsodás kimutatása APP immunhisztokémiával. Nyíl jelöli az axonsérülés kapcsán felhalmozódó APP‐t. (Részletes leíréást lásd: Hortobágyi és mtsai, 2007)
A poli(ADP‐ribóz) polimeráz (PARP) szerepe a neuronpusztulásban
A PARP (1C2.4.2.30) a sejtmagban aktív enzim, mely számos szervben, köztük az agyban is előfordul (Ha és Snyder, 2000). A PARP a DNS lánc károsodott, feltöredezett területeihez köt nagy affinitással: a nyugalmi aktivitás 500 szorosát is képes elérni (Berger, 1985; Wright és mtsai, 1996). További kedvező tulajdonsága, hogy egyéb DNS reparáló fehérjékhez is képes kötődni (de Murcia és de Murcia, 1994; Zhang és mtsai, 1994). Paradox módon, a PARP nagyfokú aktivitása mégis a sejt pusztulását eredményezheti, apoptotikus mechanizmussal (Bürkle és mtsai, 1999). Ennek oka, hogy a PARP működése nagy ATP igényű és ennek kapcsán a reperatív aktivitás mintegy feléli a sejt energiatartalékait (mely általában a DNS károsodást okozó sejttrauma miatt amúgy is limitált) és az apoptotikus kaszkád beindulását eredményezi (Muiras és Bürkle, 2000). Ezért joggal feltételezhető, hogy a PARP túlzott aktivitásának gátlása PARP inhibitorokkal akár kedvező hatású is lehet nagyfokú neuron pusztulással járó kórképekben (Takahashi és mtsai, 1999; Görlach és mtsai, 2000; Ciani és mtsai, 2001).
E hipotézis tesztelésére állatkísérleteket végeztünk. Modellként a traumás agykárosodás illetve fokális agyi lézió elfogadott módszerét az ún. hideg léziót alkalmaztuk (Klatzo és mtsai, 1958). E lézió kapcsán egy centrális, nekrotikus területet olyan zóna övez, melyben kifejezett apoptotikus aktivitás zajlik. Ez utóbbi lehet tehát az antiapoptotikus ill. egyéb neuroprotektív beavatkozások célterülete, mely bizonyos szempontból megfelel az iszkémiás stroke‐ot akut fázisban övező ún. penumbra zónának. Kísérleteinkben a neuronális NO szintetáz (nNOS) aktiválódás (ami fontos DNS károsító mechanizmus) és a PARP aktiválás kapcsolatát, a szelektív illetve kombinált inhibíció lehetőségeit vizsgáltuk modellünkben. Eredményeinek, melyek részletesen a közleményünkben szerepelnek (Hortobágyi és mtsai, 2003), igazolták, hogy a fokális agyi lézió követő korai PARP aktiváció (legalább is részben) az nNOS indukcióval kapcsolatos. Mind az nNOS, mind a PARP aktiváció gátlása az adekvát farmakon bejutatási módszer alkalmazásával hatásosan csökkenti a lézió kiterjedését.
Kísérleteinkben több koncentrációt és bejuttatási módszert (intraperitoneális, intracerebroventrikuláris) alkalmaztunk. A lézió kiterjedésének mérése mellett a PARP
aktiváció kapcsán felszabaduló PAR expresszióját illetve mennyiségét mértük immunhisztokémiai illetve immunoblot módszerekkel.
Egy másik, párhuzamosan végzett kísérlet sorozatban Lacza Zsomborral és munkatársaival a PARP gátlás más vonatkozású kedvező hatását igazoltuk agyi traumában, állatkísérletes modellen (Lacza és mtsai, 2003). A PARP gátlás a neurális
őssejt transzplantáció hatékonyságát fokozta, melyet a túlélő sejtek száma, a
funkcionális vizsgálati eredmények (neurológiai score) javulása is alátámasztott (Lacza és mtsai, 2003). A PARP jelentőségével munkacsoportom jelenleg is foglalkozik. Csonka Tamás PhD hallgató a PARP szerepét vizsgálta meningeomában, ennek a tumor grádushoz és progresszióhoz való kapcsolatát kiemelten elemezve (Csonka és mtsai, 2014).