Transzkriptomikai változások vizsgálata H3.3A-K14-mut transzgéneket

A Huntington-kór során megfigyelhető neurodegeneratív fenotípusok kialakulásának egyik fő oka a transzkripció zavara ^123,124, melyben a hisztonok acetilációs állapotának változása meghatározó szerepű ¹²². Eredményeink alapján a Huntington-kór pathogenezisében a H3.3A hiszton K14 pozíciójában található lizin acetilációs állapotának változtatása jelentős mértékben befolyásolja a HD legyek összes vizsgált fenotípusát, ezért kíváncsiak voltunk, hogy ezek hátterében transzkriptomikai változások állnak-e. A kísérlethez az elav-GAL4; tub-GAL80^ts expressziós rendszert felhasználva a 18 ºC-on történő keresztezésekből kikelő utódokat 30 ºC-ra téve adult korban indukáltuk az mHtt és a H3.3A-mut transzgének neuronális expresszióját, majd a transzkriptomikai analízist 10 napos egyedeken végeztük. Az egészséges kontroll állatok transzkriptomikai adataihoz hasonlítva az mHtt, mHtt – H3.3A, illetve mHtt – H3.3A-K14Q és mHtt – H3.3A-K14R transzgéneket expresszáló legyek esetén érdekes módon nagyságrendileg hasonló számú gén expressziós szintje változik szignifikánsan.

Az mHtt transzgént önmagában expresszáló legyekben 546 db gén expressziója változik az egészséges állatokhoz képest. A kísérleteink során kontrollként használt mHtt – H3.3A transzgéneket együttesen expresszáló legyekben ezzel szinte teljesen megegyező számú, 543 db gén expressziója változik az egészséges állatokhoz képest. Az mHtt – H3.3A-K14Q transzgéneket expresszáló mintában 492 db gén expressziója változik az egészséges kontrollhoz képest, míg az mHtt – H3.3A-K14R transzgének expressziója esetén 318 db gén expressziója változik szignifikánsan (2. táblázat).

2. táblázat: Transzkriptomikai változások az mHtt, mHtt – H3.3A és mHtt – H3.3A-K14-mut transzgéneket expresszáló egyedekben. A táblázat a differenciál génexpresszió analízis eredményét ábrázolja, melyben az egyes minták közötti statisztikailag szignifikáns változást mutató gének darabszáma látható.

kontroll mHtt mHtt − H3.3A mHtt − H3.3A-K14Q mHtt − H3.3A-K14R

kontroll - 546 543 492 318

mHtt - - 14 20 31

mHtt − H3.3A - - - 2 10

mHtt − H3.3A-K14Q - - - - 6

mHtt − H3.3A-K14R - - - -

-63

Az mHtt transzgént önmagában expresszáló legyekhez képest azonban már csak elenyésző számú gén expressziója változik az mHtt – H3.3A (14 db), illetve mHtt – H3.3A-K14Q (20 db) és mHtt – H3.3A-K14R (31 db) transzgéneket együttesen expresszáló mintákban (2. táblázat).

A kísérleteink során kontrollként használt mHtt – H3.3A expresszáló legyekhez képest pedig az mHtt – H3.3A-K14Q transzgéneket expresszáló állatok esetén összesen 2 db, az mHtt – H3.3A-K14R transzgének esetén pedig 10 db gén expressziója változik csak szignifikáns mértékben. Az mHtt – H3.3A-K14Q és az mHtt – H3.3A-K14R transzgéneket expresszáló legyek között szintén alig tapasztalható génexpresszióbeli változtás, mindössze 6 db gén expressziója változik szignifikánsan (2. táblázat). Tehát a transzkriptomikai analízis eredménye azt mutatja, hogy az egészséges kontroll állatokhoz hasonlítva az mHtt, mHtt – H3.3A, illetve mHtt – H3.3A-K14Q és mHtt – H3.3A-K14R transzgéneket expresszáló legyek esetén nagyságrendileg hasonló számú gén expressziós szintje változik szignifikánsan, míg egymáshoz viszonyítva elhanyagolható mértékű a különbség. Az adatok további vizsgálata során kiderült, hogy az egészséges kontrollhoz képest változást mutató gének nagymértékben átfednek (38. ábra).

38. ábra: mHtt-t nem expresszáló kontrollhoz viszonyított transzkriptomikai változások összehasonlítása mHtt, mHtt-H3.3A, illetve mHtt – H3.3A-K14-mut transzgéneket expresszáló egyedekben. Az ábrán az átfedést mutató gének száma látható Venn-diagram formájában.

64

A csak mHtt-t expresszáló és az mHtt – H3.3A transzgéneket expresszáló kontrollok között 76 %-os egyezés figyelhető meg a változást mutató génekben, ez az arány 68 % az mHtt – H3.3A-K14Q esetén, míg az mHtt – H3.3A-K14R esetén 43 %-os az egyezés.

Az mHtt – H3.3A és mHtt – H3.3A-K14Q transzgéneket expresszáló legyek között 72 %-os, míg az mHtt – H3.3A-K14R esetén szintén alacsonyabb, 47 %-os egyezés látható.

Az mHtt – H3.3A-K14Q és mHtt – H3.3A-K14R transzgének expressziójának hatására változást mutató gének között pedig szintén 47 %-os egyezés figyelhető meg (38. ábra).

Az egészséges kontroll egyedekhez viszonyított transzkriptomikai változások irányultságának vizsgálata során kiderült, hogy a változást mutató gének ~90 %-a downregulálódik az mHtt, mHtt – H3.3A és mHtt – H3.3A-K14-mut transzgének hatására is (39. ábra). Ez tehát arra utal, hogy az általunk használt Drosophila HD modellben a transzkripcionális diszreguláció nagymértékű génexpresszió csökkenés formájában valósul meg, mely egybevág korábbi microarray vizsgálatok eredményeivel ^123,124.

39. ábra: Upregulált és downregulált gének megoszlása az mHtt, mHtt – H3.3A és mHtt – H3.3A-K14-mut transzgéneket expresszáló egyedekben. A diagramon az egészséges kontrollhoz viszonyított génexpresszió változások iránya látható.

Az egészséges egyedekhez viszonyított transzkriptomikai változásokat génontológiai analízissel molekuláris funkciójukat tekintve is vizsgáltuk. Azonosítani tudtunk számos olyan géncsoportot, melyben dúsulás figyelhető meg HD legyekben, azonban a H3.3A-mut transzgének expressziója ezen jelentős mértékben nem változtat. Molekuláris funkciójukat tekintve az UPR (unfolded protein response) válaszban szerepet játszó hősokk fehérjéket (Hsp), illetve a nukleotid kötő fehérjéket kódoló gének esetén figyelhető meg dúsulás.

Emellett érdemes kiemelni még a katalitikus aktivitással rendelkező fehérjék csoportján belül a C-H kötések kialakításáért felelős ligáz aktivitású enzimek dúsulását (40. ábra).

504

496

444

279 42

47

48

39

65

40. ábra: mHtt-t nem expresszáló kontrollhoz viszonyított transzkriptomikaiváltozások molekuláris funkció szerint az mHtt, mHtt – H3.3A, illetve mHtt – H3.3A-K14-mut transzgéneket expresszáló egyedekben. Az ábrán a génontológiai analízis alapján molekuláris funkciójuk szerint dúsulást mutató gének csoportosítása látható.

mHtt

mHtt – H3.3A-K14Q mHtt – H3.3A-K14R

mHtt – H3.3A

66

Érdemes megjegyezni, hogy HD legyekben a nagymértékű génexpresszióbeli csökkenés ellenére egyes Hsp gének expressziója upregulálódik az egészséges legyekhez viszonyítva.

Ez az upreguláció megfigyelhető az mHtt, mHtt – H3.3A, illetve mHtt – H3.3A-K14Q transzgéneket expresszáló egyedeknél, azonban a H3.3A-K14R módosítás hatására csak a Hsp23 expressziója mutat emelkedett szintet (3. táblázat).

3. táblázat: Hsp gének expressziós szintjének változása az mHtt, mHtt – H3.3A és mHtt – H3.3A-K14-mut transzgéneket expresszáló egyedekben. A táblázatban az egészséges kontrollhoz viszonyított génexpresszió változások log2[fold change] értéke látható, a zöld-piros színátmenet az upreguláció mértékét, a vastag kiemelés a szignifikáns eltérést mutatja.

A kísérleteink során kontrollként használt mHtt – H3.3A transzgéneket együttesen expresszáló legyekhez viszonyítva az acetilációt mimikáló H3.3A-K14Q módosítás hatására enyhén csökken a Hsp gének expressziós szintje, azonban ez a változás nem szignifikáns.

Ezzel szemben a nem módosítható lizint mimikáló H3.3A-K14R mutáció hatására a Hsp23 gén kivételével szignifikánsan csökken az expressziójuk (4. táblázat).

4. táblázat: Hsp gének expressziós szintjének változása az mHtt – H3.3A kontrollhoz viszonyítva az mHtt – H3.3A-K14-mut transzgéneket expresszáló egyedekben.

A táblázatban a génexpresszió változások log2[fold change] értéke látható, a zöld-piros színátmenet a downreguláció mértékét, a vastag kiemelés a szignifikáns eltérést mutatja.

Összességében tehát a transzkriptomikai analízis eredményei alapján úgy tűnik, hogy HD legyekben az acetilációt mimikáló H3.3A-K14Q és a nem módosítható lizint mimikáló H3.3A-K14R módosítások hatására nem következik be jelentős mértékű transzkripcionális változás az mHtt – H3.3A transzgéneket expresszáló kontrollhoz viszonyítva, mely arra utal, hogy a HD legyekben a H3.3A-K14Q módosítás következtében megfigyelhető fenotípusbeli javulás nem egyszerűen a transzkripció zavarának helyreállításával valósul meg.

mHtt – H3.3A-K14Q mHtt – H3.3A-K14R

mHtt mHtt – H3.3A mHtt – H3.3A-K14Q mHtt – H3.3A-K14R

Hsp23 1,572 2,117 1,349 1,353

Hsp26 1,716 2,031 1,203 0,504

Hsp27 0,921 1,835 1,122 0,130

Hsp68 2,545 2,760 2,115 1,229

Hsp83 1,640 1,577 1,094 0,574

67

4.1.12. Totál RNS/ DNS és polyA mRNS/ totál RNS arány vizsgálata H3.3A-K14-mut