A kamrai szívizomsejtek akciós potenciálja és azt meghatározó ionáramok
Az emberi szervezetben található sejtek plazmamembránja az egymástól eltérő ionösszetételű intra-, és extracelluláris teret választja el. Az ingerelhető sejtek akciós potenciálja nem más, mint a sejtmembránon folyó térben és időben változó ionáramok következtében létrejövő feszültségváltozások. A szív ritmikus működését a szinuszcsomóban kialakuló, és innen a pitvari izomsejteken, az ingerületvezető rendszeren, majd a kamrai munkaizomzaton tovaterjedő akciós potenciálok hozzák létre. Az akciós potenciálok következtében az intracelluláris kalciumkoncentráció átmenetileg megnő, ami a szívizomsejtek összehúzódását eredményezi. Magát az akciós potenciált az emlősök szívizomsejtjeiben a plazmamembrán idő- és feszültségfüggő ioncsatornáinak konduktancia változásai hozzák létre. A szívizomsejtek akciós potenciálját öt fázisra osztjuk (1. ábra).
Az első fázis neve a nulladik fázis (0-fázis), amelyet AP felszálló szárának is neveznek a hirtelen nagymértékű membránpotenciál-változás idő-feszültség grafikonon ábrázolódó jellegzetes alakja miatt. Az akciós potenciál nulladik fázisában idő- és feszültségfüggő gyors Na+ csatornák aktiválódnak, sokszorosára növelve az addig alacsony Na+ konduktanciát. A Na+ ionokra jelentős elektrokémiai hajtóerő hat, ezáltal a csatorna nyitása is nagyon jelentős áramot eredményez, így a membránpotenciál aktuális értéke a Na+ egyensúlyi potenciálja (kb. +55 mV) felé mozdul, tehát a membrán depolarizálódik. A gyors Na+ csatornák hamar inaktiválódnak, de a refrakteritás miatt újra ingerelhető állapotba majd csak a repolarizáció után kerülnek. A gyors Na+ csatornák által okozott depolarizáció következtében egyes áramokért felelős ioncsatornák aktiválódnak, míg mások inaktiválódnak. A nyugalmi membránpotenciál fenntartásáért felelős K+-áram (befelé egyenirányító K+ áram, IK1) lecsökken a befelé történő egyenirányítás miatt, ez megakadályozza repolarizáló hatású K+ áram létrejöttét a nulladik fázis alatt. A depolarizáció hatására ugyanakkor egy korai tranziens kifelé irányuló K+-áram (“transient outward potassium current”, Ito) is aktiválódik. Az Ito felelős az akciós potenciál első fázisában tapasztalt gyors, átmeneti repolarizációért („notch” kialakulása).
Az akciós potenciál második fázisáért (az ún. plató fázisért) a főként Ca2+ ionokat szállító lassú befelé irányuló áram a felelős. A plató fázis alatt nem történik jelentősebb
mértékű repolarizáció az Ito inaktiválódása és a K+ (IK1) csatornák befelé történő egyenirányítása miatt.
1. ábra. A pitvari (bal oldali mező) és kamrai (jobb oldali mező) szívizomsejtek akciós potenciáljának fázisai és az ezeknek megfelelő ionáramok. Az AP mellett feltüntetett arab számok az AP egyes fázisait jelölik. Az akciós potenciál alatt a membránpotenciál-változást előidéző transzmembrán ioncsatorna-áramok vannak vázlatosan feltüntetve. A lefelé irányuló nyilak az extracelluláris térből a szívizomsejtbe történő kationmozgást (inward áram), míg a felfelé mutató nyilak a szívizomsejtből az extracelluláris térbe történő kationmozgást (outward áram) jelölik. Az ionáramok rövidítései: INa = befelé irányuló gyors Na+-áram; ICaL = befelé irányuló L-típusú Ca2+ -áram; INCX = nátrium-kalcium cseremechanizmus (NCX) áram; ICaT = T-típusú Ca2+-áram; IK1 = befelé egyenirányító K+-áram; IK,ACh = acetilkolinfüggő K+ áram; Ito1 = tranziens kifelé irányuló K+-áram;
Ito2 = Ca2+-aktiválta K+-áram; IKur= késői egyenirányító kifelé irányuló K+-áram ultragyors komponense; IKs = késői egyenirányító, kifelé irányuló K+-áram lassú komponense; IKr = késői egyenirányító, kifelé irányuló K+-áram gyors komponense; ICl = klorid áram; IK,ACh = acetilkolin-függő befelé egyenirányító K+ áram, If = befelé irányuló pacemaker-Na+-áram; IKATP = ATP-függő K+ áram.
INa/K = nátrium-kálium pumpaáram.
Az AP harmadik fázisában kezdődik meg a repolarizációs folyamat, mely az AP negyedik fázisára visszaállítja a membránpotenciál nyugalmi értékét. A repolarizációt számos áram együtt hozza létre. A kezdeti szakaszt az ICa,L áram inaktivációja határozza meg leginkább. Később egyre nagyobb szerep jut a késői egyenirányító („delayed rectifier”) K+
-áram (IKr és IKs) gyors és lassú komponenseinek, majd a repolarizációt, és a sejtek membránpotenciáljának helyreállítását is a befelé egyenirányító káliumáram, az IK1 áram teszi teljessé. Ezen kívül meg kell említeni két fontos pitvarszelektív repolarizáló áramot is.
Az egyik a késői egyenirányító káliumáram ultragyors komponense, az IKur, és egy ligandvezérelt áram, a G-protein stimuláció hatására nyíló acetilkolin szenzitív befelé egyenirányító káliumáram, az IKA,Ch.
Az AP negyedik fázisa (elektromos diastole) során az extranodalis (automáciával nem rendelkező) miociták, így a kamrai sejtek membránpotenciálja is a nyugalmi értéken marad egészen az újabb AP kezdetéig. A 4. fázist meghatározó nagy K+ konduktancia (amely az IK1 áramot eredményezi) felelős azért, hogy a kamrai miociták nyugalmi membránpotenciálja a K+ ionok egyensúlyi potenciáljához közeli érték (kb. -90 mV).
A „régi” antiaritmiás gyógyszerek proaritmiás mellékhatásainak felfedezése, és a modern, elsősorban multichannel jellegű, ún. „amiodaron-szerű” gyógyszerek iránti igénynek a megfogalmazása
A Cardiac Arrhythmia Suppression Trial vizsgálatok (CAST I-II) bebizonyították, hogy a Vaughan Williams I/C hatástípusú Na+-csatornagátló antiaritmiás gyógyszerek (flekainid, enkainid, moricizin) az iszkémiás eredetű kamrafibrilláció (VF) fellépését megkönnyítő ún.
profibrilláns hatás révén –a post-infarktusos kamrai extrasystolia látványos szuppressziója ellenére– növelik a teljes és hirtelen halálozást (Lazzara 1996; Singh 1999). Aggályokat ébresztettek az I/A típusú kinidinnel végzett randomizált klinikai vizsgálatok eredményeiből származtatott meta-analitikus adatok is, és felvetették annak a gyanúját, hogy bizonyos betegcsoportokban ennek a klasszikus antiaritmiás gyógyszernek is erős proaritmiás hatása van, ami mortalitás-növekedésben nyilvánulhat meg (Fazekas, 1999a; Varró, 2009). Az a felismerés, hogy a szupraventrikuláris és kamrai tachyaritmiák túlnyomó többsége az impulzus körforgásán (reentry) alapszik és az ingerületvezetést lassító Na+-csatornagátlók nem ritkán inkább elősegítik a reentry-aktivációt (Fazekas, 1994), paradigma-váltáshoz vezetett, ami elsősorban abban nyilvánult meg, hogy a gyógyszerfejlesztésben résztvevő kutatók és a klinikusok érdeklődése egy másik alapvető antiaritmiás+antifibrilláns terápiás princípium, a repolarizáció gyógyszeres megnyújtása felé fordult (Singh, 1994; Wang, 1994;
Bril, 1996; Lazzara 1996; Fazekas, 1996 és 1999b; Katrisis 1997; Salata, 1997; Conolly, 1999; Torp-Pedersen, 1999). Singh és Vaughan Williams 1970-ben egy új farmakoterápiás irányzat elektrofiziológiai alapjait fektették le, amikor kimutatták, hogy a d,l-sotalol (MJ 1999) és a krónikus amiodaron-előkezelés erőteljesen megnyújtja a szívizomsejtek akciós
potenciáljának időtartamát (APD) és effektív refrakter periódusát (ERP); az újfajta elektrofiziológiai effektust III-as típusú antiaritmiás hatásnak nevezték el (Singh, 1970a;
Conolly, 1994, Singh, 1999). Ezen kutatási és terápiás irányzat erősödése jegyében több olyan új, „tiszta” („pure drug”) K+-csatorna-blokkoló molekulát fejlesztettek ki, amelyek többségéről (dofetilid, d-sotalol, almokalant, sematilid, E-4031) kiderült, hogy a repolarizációban döntő szerepet betöltő késői egyenirányító K+-áram gyors komponensének (IKr) szelektív gátlószere (Gough, 1989; Jurkiewicz, 1993; Darpö, 1996; Katrisis, 1997;
Salata, 1997; Torp-Pedersen, 1999).
A károsodott bal-kamrafunkciójú post-infarktusos betegeken d-sotalollal végzett prospektív, randomizált, kettős-vak SWORD (Survival With ORal D-sotalol) vizsgálat mindazonáltal azt bizonyította, hogy az IKr szelektív gyógyszeres blokkja is jelentős proaritmia-kockázattal és mortalitás-növekedéssel szövődik (Waldo, 1996; Pratt, 1998). Az APD-t és ERP-t megnyújtó gyógyszerjelöltek kutatása természetesen a SWORD után is folytatódott, az új cél azonban már nem „tiszta” IKr-ionáramgátlók, hanem olyan
„multichannel” („dirty drug”), vagy ún. „amiodaron-szerű” antiaritmikumok kifejlesztése volt, amelyekben a repolarizációt megnyújtó (III-as osztályú) hatás egyéb, előnyösnek vélt farmakológiai tulajdonsággal (kombinált III+I/B, II és/vagy IV osztályú aktivitás) ötvözve jelentkezik (Brill, 1996; Nattel, 1999).
Ezt követően a kilencvenes éve második felében azok az új K+-csatornagátlók kerültek az érdeklődés homlokterébe, amelyek nemcsak az IKr-t gátolják, hanem ugyanezen kationáram lassan aktiválódó összetevőjét (IKs) is blokkolják. A kombinált IKr+IKs gátlástól ugyanis a Sanguinetti-Jurkiewicz hipotézis (Jurkiewicz, 1993) alapján több szerző az ún.
fordítottan frekvencia-függő („reverse use-dependent”) APD-megnyúlás. és az arra visszavezethető kamrai proaritmiás aktivitás gyengülését vagy elmaradását remélte (Salata, 1997; Dorian, 1999; Singh, 1999; Viswanathan, 1999). Ennek a következő a magyarázata.
A hirtelen bekövetkező szívfrekvencia növekedés (például korai extrasystole) vagy a tartós, egyensúlyi („steady-state”) tachycardia által indukált APD rövidülés (APD restitúció, illetve APD-adaptáció) létrehozásában résztvevő elektrofiziológiai mechanizmusok nem kellő mélységű ismeretéből az is következik, hogy nincsenek pontos, mindenki által elfogadott eredményeink a fordítottan frekvenciafüggő (reverse rate-dependent) repolarizáció megnyúlás hátterében álló ioncsatornaszintű eseményekre vonatkozóan sem. Sanguinetti és Jurkiewicz tengerimalac kísérleteken alapuló hipotézise nyomán évekig feltételezték, hogy a szelektív IKr -blokkolók (dofetilid, E-4031, almokalant) repolarizációt megnyújtó hatása azért csökken vagy szűnik meg a magas szívfrekvencia tartományban, mert a késői
egyenirányító K+-áram ezen állatfajban lassan aktiválódó és deaktiválódó összetevője (az IKs) a rövid diastoles intervallumok miatt tartósan nyitva marad, felerősödik („IKs -akkumuláció”), ami másodlagos APD rövidüléshez vezet. Ennek megfelelően azt a hipotézist vetették fel, hogy az IKs szelektív gátlása mentes volna az IKr gátlókra jellemző fordított frekvenciafüggő hatástól (Jurkiewicz, 1993).
A Sanguinetti-Jurkiewicz hipotézis felvetéseit követve több vegyület vizsgálatát tűztük ki célul. Ezek között voltak olyan új originális innovatív gyógyszerjelölt molekulák, mint az amiodaron kongéner vegyület az SR-33589 (dronedaron), az amiodaronszerű tulajdonságokkal felruházott kombinált III+I/B osztályú GYKI-16638, valamint a multichannel gátló molekulaként kifejlesztett KC-8857 (tedisamil). Ezen kívül a Sanguinetti és Jurkiewicz hipotézis tanulságait is figyelembe véve, a proaritmiás mellékhatások celluláris mechanizmusának megismerése céljából összehasonlításként, megvizsgáltuk néhány régóta ismert és széleskörűen használt antiaritmiás gyógyszer hatását (az I/A osztályú szerként ismert prokainamid, kinidin és disopyramid) a transzmembrán ionáramokra.
A szívizom repolarizációjában részt vevő különböző káliumcsatornák kölcsönhatásainak vizsgálata emlős kamraizmon - a repolarizációs tartalék fogalma és jelentősége
Mint már az előző alfejezetben is volt róla szó, a szívritmuszavarok gyógyszeres kezelésének egyik lehetséges és kiemelkedően fontos módja az akciós potenciál időtartamának (APD), illetve effektív refrakter periódusának a megnyújtása, amit a Vaughan Williams féle klasszifikációban III osztályú antiaritmiás hatásnak nevezzünk (Singh, 1970a).
Számos nem szívre ható gyógyszer repolarizáció megnyúlást idéz elő a kamrai szívizomban és a Purkinje rostokban egyaránt azáltal, hogy egy vagy több káliumáramot blokkol (Antzelevitch, 1996; Drici, 2000a; Gintant, 2001). Ma már köztudott, hogy az akciós potenciál időtartamának megnyúlása bizonyos helyzetekben proaritmiás szövődményhez (Torsades de Pointes típusú kamrai tachycardia) vezethet, melynek következtében növekszik a gyógyszer okozta összmortalitás. A kamrai repolarizáció a sejtbe befelé haladó, mint például a gyors Na áram (INa) és L-típusú kalciumáram (ICa) és a sejtből kifele haladó ionáramok, mint például. a tranziens kifelé irányuló kálium áram (Ito), a késői egyenirányító káliumáram gyors (IKr) és lassú komponense (IKs) valamint a befelé egyenirányító káliumáram (IK1) finom egyensúlyaként jön létre. A klinikai tapasztalatok azt mutatták, hogy fiziológiás körülmények között a káliumcsatornák egyetlen típusának sérülése vagy gyógyszeres gátlása kifejezett, potenciálisan veszélyes APD megnyúlást várhatóan nem
eredményez, mivel a többi káliumáram megfelelő repolarizációs plusz kapacitást képes biztosítani. Ezt a jelenséget nevezte el Roden professzor „repolarizációs tartaléknak”
(„repolarization reserve”) (Roden, 1998 és 2005), amelyről először egy klinikai jellegű hosszú QT szindrómás közleményhez írott szerkesztőségi levélben („editorial”) a következőképpen fogalmaz:
„Nagyobb probléma megjósolni a Torsades de Pointes aritmiák megjelenését alacsony gyógyszer plazmakoncentrációk esetében. Ezért javasoljuk bevezetni a repolarizációs rezerv fogalmát. Ennek szellemében azt feltételezhetjük, hogy az egészséges kamrai szívizomszövetben egy gyors és biztonságos repolarizációs rendszer létezik, amely nem teszi lehetővé a reentry aritmiás körök, illetve az aritmogén korai utódepolarizációk (EAD) kialakulását. Valójában a gyors (IKr) és lassú (IKs) késői egyenirányító káliumáramok normális működése a fő biztosítéka a stabil és biztonságos repolarizációnak, és így a szívizomnak erős repolarizációs tartaléka van. Meghatározott Torsades de Pointes aritmiát előidéző kockázati tényezők csökkentik ezt a repolarizációs tartalékot, és így valószínűsíthető, hogy olyan további behatások, mint például a genetikai károsodás, az IKr gátló gyógyszerek alkalmazása már elégségessé válnak ahhoz, hogy egy adott betegben a Torsades de Pointes aritmia kialakulhasson” (Roden, 1998).
Annak ellenére, hogy a fentiekben említett koncepció, illetve definíció minden kísérletes bizonyíték nélkül pusztán elméleti spekuláció eredményeként született, igen gyorsan komoly visszhangot váltott ki. Ezt a megjelenését követő évben már 16 és a mai napig érkezett összesen több mint 400 idézet is bizonyítja. A repolarizációs rezerv első megfogalmazását követő években nyilvánvalóvá vált, hogy segítségével értelmezhetővé válnak azok a váratlan proaritmiás komplikációk is, amelyek egyébként nem jártak együtt a repolarizáció és/vagy a QT intervallum számottevő megnyúlásával.
Munkacsoportunk egy teljesen más megközelítésben jutott el a repolarizációs tartalék fogalmához, amelynek az lett az eredménye, hogy az IKs transzmembrán káliumáram élettani szerepének tisztázása során kísérletes bizonyítékokkal elsőként igazoltuk a repolarizációs rezerv jelentőségét a túlzott mértékű repolarizáció megnyúlás következtében kialakuló aritmiás kockázat megnövekedésében (Varró, 2000).
Nem sokkal azt megelőzően, hogy az előzőleg már említett módon a repolarizációs rezerv megfogalmazásra került volna, laboratóriumunkban már rendelkeztünk azokkal az új specifikusnak tekinthető IKs gátló vegyületekkel (chromanol 293B, L-735,821 és HMR-1556), amelyekkel lehetővé vált, hogy vizsgáljuk az IKs áramnak a szívizom repolarizációjában betöltött szerepét. Ezeknek a kísérleteknek az eredeti célja egy a
Sanguinetti és Jurkiewicz által széleskörűen ismert és elfogadott hipotézis (Jurkiewicz, 1993) experimentális bizonyítása volt. Mint az előző alfejezetben már röviden taglaltam, ezen hipotézis szerint az IKs farmakológiai úton történő gátlása - a korábban a gyors késői egyenirányító (hERG) káliumcsatorna (IKr) gátló sotalol és dofetilid hatásával ellentétben - vélhetően nem fordított (reverse) use dependens módon nyújtja meg a szívizom repolarizációját. A Sanguinetti-Jurkiewicz hipotézis szerint, amelyet korábbi tengerimalac miocitákon végzett patch-clamp kísérletek eredményei alapoztak meg az akciós potenciálok során kinyílt (aktiváció) IKs transzmembrán ioncsatornák – a repolarizáció során lassan zárulnak be (deaktiváció). Ez azt jelentené, hogy magas szívfrekvenciáknál az IKs csatornák egy része nyitott állapotban maradna, és rajtuk keresztül jelentős mértékű repolarizáló K+ -áram folyna keresztül, és így nagymértékben hozzájárulna a tachycardia során tapasztalható repolarizáció rövidüléséhez (Sanguinetti, 1990; Jurkiewicz, 1993). Ezzel összhangban az IKr
gátló szerekkel ellentétben az IKs csatornák gátlása elsősorban gyors szívfrekvenciáknál, azaz tachycardiában lenne kifejezett, amely terápiásan igen előnyös ERP megnyújtó antiaritmiás hatást eredményezne csekély proaritmiás kockázat mellett. Mindezeket figyelembe véve számos elméleti farmakológus, és gyógyszergyár az IKs gátló antiaritmiás gyógyszerek fejlesztésébe kezdett (Schreieck, 1997; Bosch, 1998; Shimizu, 1998). A korszellemnek megfelelően, mi is foglalkozni kezdtünk az IKs gátló szerek celluláris hatásmódjának a vizsgálatával.
Jelen munkánk célja az volt, hogy a celluláris elektrofiziológia eszköztárát felhasználva, megvizsgáljuk az egyes káliumáramok egymás közötti kölcsönhatását, és kísérletesen igazoljuk a repolarizációs tartalék lehetséges szerepét a kamrai szívizom repolarizációja során. Kísérleteinkben megvizsgáltuk az IKs és IK1 áramok szelektív gátlásának hatásait kutya, illetve egészséges emberi kamrai APD-re miután a repolarizációs tartalékot szelektív IKr gátlással, illetve a szimpatikus stimuláció fokozással előzetesen legyengítettük. A hipotézist tovább ellenőrizve megvizsgáltuk mi történik, hogyan változik meg az IK1 áram dilatatív cardiomiopátiaban, illetve megvizsgáltuk az IKs áram fokozásának (aktiválásának) a lehetséges szerepét az akciós potenciál repolarizációjára.
3. témakör: A pitvarfibrillációs remodelling celluláris hatásmechanizmusainak vizsgálata