A szuperoxid gyök felhalmozódása

A szuperoxid gyök csak az elhaló sejtekben mutatható ki, és csak a nek-rózissal járó gazda – parazita kapcsolatokat jellemzi. A lokális klorózis és a mozaik tünetek esetén nem mutatható ki szuperoxid felhalmozódás.

Evans-kék festődés is csak a nekrózissal járó tünetekre jellemző. Az Evans-kékkel festődő egysejt-léziók megjelentekor, a TMV/TNV fertő-zött növényekben (a fertőzést követően kb. 38-40 óra elteltével) a szu-peroxid gyök felhalmozódása is megkezdődött. Először a gyök mennyi-sége nőtt meg, ezt követte a membránok áteresztővé válása (Evans-kék festődés), végül bekövetkezett a sejthalál. A fertőzött sejtből kiindulva a nekrózis kifejlődése során a szuperoxid gyök először csak néhány, a fer-tőzött sejttel szomszédos sejtben mutatható ki (11. ábra/C), majd a foko-zatosan térben táguló nekrózis körüli gyűrűben (11. ábra/A).

A nekrotikus folt növekedésének ideje alatt az elhalt középső rész körül gyűrű alakban elhelyezkedő sejtek sok szuperoxidot termeltek (12. ábra).

A fertőzés későbbi szakaszában (4. nap után) a léziók növekedése lelas-sult, a körülöttük felszaporodott szuperoxid mennyisége csökkent, majd a teljesen kifejlett (elöregedett) nekrózisok körül leállt.

11. ábra A TMV-fertőzött és specifikusan festett Chenopodium levelek. Az A) képen Evans-kék és NBT kettős festés látható. A sötétkék színű Evans-kék a károsodott membránú sejteket festi, körülötte barna színű gyűrűt képez a szu-peroxidra specifikus NBT. A nagyítás 40-szeres. NBT-festés látható a B) és C) képeken. Az A) és B) kép 3 nappal, a C) kép 40 órával a fertőzés után készült.

Az uborka esetében az SzSzR csak a TNV-vel fertőzött növényekben fejlődött ki. A CMV nem indukálta a rezisztenciát, míg a ZYMV-vel fertőzött növényekben a második fertőzéskor mérséklődött ugyan a TNV nekrotikus lézióinak nagysága, de ennek nem tulajdonítottunk jelentősé-get, mivel az indukáló vírus is jelen volt a növényekben, illetve inkább lokális rezisztenciáról volt szó. Az SzSzR hatására a második fertőzés nekrotikus léziói kisebbek, és kevesebb szuperoxidot termeltek (13. áb-ra).

A

B

C

12. ábra A TNV-fertőzött uborkanövényekben az NBT festést követően a növé-nyekből kivontuk a színanyagokat, így jól látszik a formazán lilás elszíneződé-se, A) fiatal, B) elöregedett nekrózisok

13. ábra NBT festés uborkán, A) rezisztenciával rendelkező növények felülfer-tőzése TNV-vel, B) kontroll növények vírusferfelülfer-tőzése, C) a Chenopodium quinoa TNV fertőzése SzSzR-el rendelkező (bal) és kontroll (jobb) leveleken

A B

A B

C

Szécsi et al. (1999) az Aquorea victoria medúzából származó zöld fluo-reszcens fehérjének (green fluorescent protein, GFP) fúziós fehérjeként történő alkalmazásával, több idegen gént tartalmazó GFP-vel jelölt fertő-ző transzkriptumot készítettek. Fluoreszcens mikroszkóppal és immunocitokémiai módszerekkel vizsgálták a TMV Nicotiana benthamiana-n kialakult tüneteit, ezek segítségével sikerült képet alkotni a TMV nekrotikus léziójának sejt és szöveti szintű kialakulásáról. A GFP-vel jelölt TMV-MP:GFP (MP-movement protein, a vírus sejtben történő mozgásáért felelős fehérje) replikátumok nagy mennyiségben az erősen fluoreszkáló gyűrű szélén, míg a TMV-∆C-GFP replikátumok (a köpenyfehérje helyére kerül a GFP) a gyengén fluoreszkáló gyűrű belse-jében (felülnézetben korongot formázva) halmozódnak fel nagy menyiségben. A gyűrű illetve korong ugyan fedi egymást, de a gyűrű sokkal nagyobb. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a TMV replikációjának a növényi szövetben térben és időben meghatározott formája illetve sorrendisége van. A vírus RNS akkumulációjának formája párhuzamba állítható a szuperoxidot termelő sejtek festődésével (lásd 14.

ábra).

Továbbá érdekes az a megfigyelés, miszerint az uborkanövényeken a TNV okozta léziók közvetlen közelében gyakran a hajszálerek is festőd-tek NBT-vel (15. ábra), ez magyarázható azzal, hogy az „A” szerotípusba tartozó TNV képes belépni a hajszálerekbe, és ezáltal a babon okozott tipikus tünete a nekrotikus léziók mellett a hajszálerek mentén kialakított érnekrózis, ami nagyban megkülönbözteti a „D” szerotípusba tartozó tör-zsektől. Az ereknek ez a típusú festődése az elöregedő lézióknál már nem

14. ábra A) A vírus RNS akkumulációjának specifikus mintázata Szécsi et al., (1999) nyomán, B) valamint a nekrotikus gyűrű NBT-vel történő festődése

15. ábra A nekrózisok körüli hajszálerek festődése

Az alsó levelek TMV-fertőzése rezisztenciát indukált a felső levelekben, ami kisebb méretű léziókat eredményezett. Fontos elméleti összefüggésre mutat rá Chivasa et al., 1997-es közleménye, amely a szalicilsav TMV akkumulációjára gyakorolt hatásáról szól, miszerint valószínű, hogy a szalicilsav gátolja a vírus RNS-függő RNS polimerázát. Az SzSzR során szisztemikusan korábban indukálódó és felhalmozódó szalicilsav gátolja a vírus replikációját, így a kevesebb számban képződő virionok kisebb

A B

szalicilsav ezen hatása gátolható szalicilhidroxámsavval (SHAM), amely vegyület többek között az alternatív oxidáz inhibtora is. Amikor a nekrotizáció mértéke a szerzett ellenállósággal rendelkező levelekben csökkent, a szuperoxid gyök mennyisége is csökkent, ez a visszaszoruló TMV RNS replikációjával is korrelációban állhat.

Fontos lehet még az az összefüggés, miszerint a vírus mozgásért felelős fehérjéje legnagyobb mennyiségben 13-16 óra között van jelen a szöve-tekben és a fehérje termelődése 30-40 óra között leáll. A szuperoxid fel-halmozódásának ideje egybeesik ezzel az időszakkal (36-38 óra), a szö-veti hőmérséklet növekedés ideje pedig 39 óra körül van (Chaerle et al., 1999). Vizsgálataikban termográfiásan kimutatták a keletkező nekrózisok körüli hőmérséklet emelkedést, továbbá szalicilsav-termelődést a fertőzés prenekrotikus szakaszában. A hőmérséklet növekedéséért a szalicilsav által indukált sztómazáródást tették felelőssé. Mindenesetre a TMV szö-veten belüli elterjedése és a szuperoxid felszaporodása között párhuza-mot lehet vonni. A klorotikus léziót képző valamint a mozaik tünetekkel járó gazda-parazita kapcsolatokban nem sikerült szuperoxid felhalmozó-dást kimutatni, (16. ábra) ami az OAF második, specifikus hullámának hiányáról tanúskodik. Továbbá a sejthalált sem sikerült kimutatni, ami a sejtmembránok integritására utal.

Mindez a szuperoxid-felhalmozódás és a sejthalál ok-okozati összefüggé-sét jelzi inkább. A szuperoxidnak a vírus elleni antimikrobiális, közvetlen hatása nem bizonyított, bár elméletben a szuperoxid az RNS molekulák-kal is képes reakcióba lépni (Halliwell és Gutteridge, 1999). A szuper-oxid gyűrű kialakulása és a felhalmozódó vírus RNS specifikus mintázata között is összefügést feltételezhetünk

16. ábra A) NBT festés SoMV-vel és B) ZYMV-vel fertőzött Chenopodium quinoa növényeken, sem a mozaik tünet sem a klorotikus léziók nem festődtek