A pollen eredetű oxidatív stress hatása az azonnali túlérzékenységi reakciókra és a

kötőhártya-gyulladás egér modelljében

Az előző vizsgálatunkban kimutattuk, hogy a klinikumban az allergiás bőrtesztekhez (Prick-teszt) használt pollen kivonatok NADPH oxidáz aktivitással rendelkeznek. Ebben a kísérletsorozatban az intakt pollenszemek ROS-termelő képességét tanulmányoztuk.

Először az egyik legfontosabb szezonális légúti allergént, a parlagfű pollent teszteltük. A hidratált parlagfű pollenszemek (ragweed pollen grains, RWP) a redox-érzékeny H₂DCF-t fluoreszcens DCF-né alakították át, ezzel szemben a hőkezelt (72°C, 30 perc) RWP (RWP^H) nem volt képes erre (12. ábra).

12. ábra. A hidratált parlagfű pollenszemek (RWP) ROS termelésre képesek Bal oldali képek: a hidratált RWP és a hőkezelt RWP (RWP^H) DCF fluoreszcenciája mikroszkópos felvételen. A jobb oldali képek: a pollenszemek fáziskontraszt képei. Nagyítás:

100x. A képek 3 független kísérletet reprezentálnak.

A H2DCF különböző típusú reaktív oxigén származékokkal is reakcióba léphet [206].

Annak érdekében, hogy meghatározzuk milyen típusú ROS termelődik elsődlegesen pollen hidratációt követően, NBT esszét végeztünk. A RWP dózisfüggő módon formazánná redukálta a NBT-ot, ami O2•

keletkezésére utalt. Az NBT esszé segítségével megvizsgáltuk további 42 növényfaj - néhányat a 13. A ábra mutat be - pollenszemeinek ROS termelését. A

hidratált pollenszemek felszínén a NBT hozzáadását követően formazán képződés volt megfigyelhető az összes vizsgált növényfaj esetében. A képződő formazán mennyisége szignifikánsan fokozódott NADPH, sőt NADH jelenlétében is (13. A és B ábra), ugyanakkor sem a NADPH, sem a NADH önmagában nem reagált a NBT-mal (az adatokat nem mutatom). Ez azt mutatja, hogy a O₂^•--termelő pollen oxidázok NADPH-ot és NADH-ot is képesek szubsztrátként használni, szemben a fagociták oxidázaival, amelyek szinte kizárólag NADPH felhasználásával termelnek O₂^•--t [207]. Az RWP előkezelése Tironnal, vagy SOD-zal jelentősen csökkentette a formazán keletkezését (I. Táblázat). A pollenszemek általi NBT redukció gátolható volt DPI és QA NADPH oxidáz inhibitorokkal, míg a növényi peroxidázok inhibitoraként használatos aziddal nem [207-209], ami megerősíti, hogy NAD(P)H oxidázok állnak a pollenszemek ROS termelésének hátterében.

Az O₂^•- gyorsan átalakul H₂O₂-dá akár nem-enzimatikus úton, akár SOD jelenlétében [210, 211], és a pollenszemekről már korábban kimutatták, hogy tartalmaznak SOD-t [211]. Ebből kiindulva, a következő kísérletben nem az elsődlegesen termelődő O₂^•--t, hanem a belőle kialakuló H₂O₂-t próbáltuk kimutatni Amplex Red esszé alkalmazásával [212]. A RWP szuszpenzióban kimutatható volt H₂O₂, és a mennyisége tovább növelhető volt NADH vagy NADPH hozzáadásával (13. C ábra). A H₂O₂ keletkezése gátolható volt, ha a RWP-t Tironnal kezeltük elő (13. C ábra). Hasonló eredményeket figyeltünk meg más gyomnövények, fű- és fafélék pollenszuszpenziói esetében is (az adatokat nem mutatom). A fenti megfigyelések alapján a pollenszemekben található NAD(P)H oxidázok O₂^•--t állítanak elő, amelyet szintén a pollenben található SOD tovább alakíthat H₂O₂-dá.

I. Táblázat. A parlagfű pollenszemek szuperoxid anion termelése

A következőkben megvizsgáltuk, hogy a hidratált pollenszemek NAD(P)H oxidázai által termelt O₂^•--nak van-e hatása az intracelluláris ROS szintjére NHBE és A549 sejtekben.

Ehhez a sejteket H₂DCF-DA-tal töltöttük meg, és a DCF fluoreszcencia változását fluorimeter vagy fluoreszcens mikroszkóp segítségével detektáltuk.

13. ábra. A különböző pollenszemek általi szuperoxid anion termelés

(A) A nitro-blue tetrazolium (NBT) formazánná redukálása különböző fajok pollenszemei által. ■: pollenszem szuszpenzió; □, pollenszem szuszpenzió + NADH; ■: pollenszem szuszpenzió + NADPH; Bermuda: csillagpázsit (Cynodon dactylon); Redtop: fehér tippan (Agrostis alba); Timothy: mezei komócsin (Phleum pratense); Birch: közönséges nyír (Betula pendula); Oak: tölgy (Quercus sp.); Plantain: lándzsás útifű (Plantago major); Pigweed:

szőrös disznóparéj (Amaranthus retroflexus); Thistle: homoki ballagófű (Salsola kali). (B) Formazán kristályok kiválása a pollenszemeken. Bal oldali kép: hidratált parlagfű pollen (RWP). Középső kép: hidratált RWP + NBT. Jobb oldali kép: hidratált RWP + NBT + NADPH.

Nagyítás: 100x. (C) H2O2 detektálása RWP szuszpenzióban Amplex Red esszével. Az eredményeket átlag ± SEM formában ábrázoltuk. *P < 0,05; **P < 0,01.

A RWP kezelés dózisfüggően növelte az intracelluláris DCF jelet a NHBE sejtekben, ami fokozható volt SOD és gátolható Tiron hozzáadásával (14. A ábra). Az intracelluláris DCF jelek változását A549 sejtekben fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. A fáziskontraszt és a fluoreszcens képek egymásra illesztésekor kiderült, hogy azokban a sejtekben emelkedett meg jelentősen az intracelluláris ROS szintje, melyek közvetlenül érintkeztek a pollenszemekkel (14. B ábra).

14. ábra. A parlagfű pollen (RWP) kezelés megnöveli tenyésztett epitél sejtekben a ROS szintjét

(A) Dózisfüggő DCF fluoreszcencia növekedés RWP-nel kezelt primer NHBE sejtekben. ■:

RWP; □: RWP + SOD; ■: RWP + Tiron; AU: tetszőleges egység. Az eredményeket átlag ± SEM formában ábrázoltuk. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. (B) A közvetlen érintkezés a pollenszemekkel megnöveli az intracelluláris ROS szintjét az A549 sejtekben. Bal oldali kép:

DCF fluoreszcencia az A549 sejtekben. Középső kép: a RWP-nel kezelt A549 sejtek fáziskontraszt képe. Jobb oldali kép: a fáziskontraszt és a fluoreszcens képek egymásra illesztése. Nagyítás: 200x.

A pollenszemek NAD(P)H oxidázai által generált O₂^•--nak az intracelluláris ROS szintjére gyakorolt hatásának in vivo tanulmányozásához naív és szenzitizált egerek kötőhártya epitél sejtjeit H₂DCF-DA-tal töltöttük fel, és RWP-nel vagy PBS oldattal kezeltük.

A kezelés után 15 perccel az egereket túlaltattuk, szemeiket eltávolítottuk, fagyasztottuk, majd szövettani metszés után fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. A PBS nem, míg a RWP kezelés jelentősen megnövelte a ROS szintjét a kötőhártya epitél sejtjeiben. A RWP előkezelése Tironnal meggátolta az intracelluláris ROS mennyiségének emelkedését (15.

ábra). Hasonló jelenség volt megfigyelhető a naív és szenzitizált egereknél is, ami arra utal, hogy a RWP által indukált oxidatív stressz a kötőhártyában független az adaptív immunválaszoktól.

15. ábra. A ROS szintjének változása az egerek kötőhártyájában helyi parlagfű pollen (RWP) kezelés után

Felső képek: DCF fluoreszcencia az egerek kötőhártyájában PBS, RWP és RWP + Tiron kezelés után. Alsó képek: a megfelelő szöveti területek fáziskontraszt képek. A felvételek 4 egérből álló csoportok konjuktiva metszeteit reprezentálják. Nagyítás: 40x.

Annak vizsgálatára, hogy a pollenszemek NAD(P)H oxidázai által indukált oxidatív stressznek van-e szerepe az allergiás kötőhártya-gyulladás azonnali reakcióinak kialakulásában RWE-szenzitizált egereket kezeltünk PBS oldattal, RWP-nel, RWP^H-nel, valamint Tironnal előkezelt RWP-nel. Az egerek allergiás tüneteit (kötőhártya-duzzanat, kötőhártya-vörösség, szemhéj ödéma, viszketés és könnyezés) 20 perccel a kezelések után vizsgáltuk, és egy klinikai pontrendszer szerint 0-4 pont között értékeltük, korábbi vizsgálatoknak megfelelőn [213] (II. Táblázat).

II. Táblázat. Klinikai pontszámok és hízósejt degranuláció

A RWP kezelt egerek átlag klinikai pontszáma 8,7±0,6 (átlag±SEM) volt. A klinikai tünetek lényegesen enyhébbek voltak RWP^H kezelés (2,2±0,75), vagy Tironnal előkezelt pollennel történő expozíció esetében (2,4±0,5; II. Táblázat). Az eredmények megerősítéséhez az egereket RWP^H-nel és X+XO-zal együttesen kezeltük. A X+XO által előidézett oxidatív stressz súlyosbította a RWP^H-nel kezelt egerek klinikai tüneteit 2,2±0,75-ről 6,3±0,5-re, míg a X+XO önmagában nem idézett elő azonnali allergiás tüneteket a szemben (II. Táblázat). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a RWP NAD(P) oxidázai által okozott oxidatív stressz felerősíti az antigén-indukálta korai túlérzékenységi tüneteket az allergiás kötőhártya-gyulladás egér modelljében.

Megvizsgáltuk azt is, hogy a RWP által generált oxidatív stressz befolyásolja-e a hízósejtek degranulációjára és a gyulladásos sejtek infiltrációját a kötőhártyába. A korai- (degranuláció), valamint késői (eozinofil infiltráció) fázisoknak megfelelő időpontokat egy előzetes vizsgálat eredményei alapján jelöltük ki [213]. A degranulált hízósejtek számát a kötőhártya-szövetben 3 órával a RWP kezelés után határoztuk meg. A hízósejt degranuláció a RWP^H, valamint a Tironnal előkezelt RWP kezelést követően szignifikánsan alacsonyabb volt az RWP expozícióhoz képest (16. ábra; II. Táblázat).

16. ábra. A parlagfű pollen (RWP)-indukálta oxidatív stressz hatása a hízósejtek degranulációjára

Az egerek kötőhártyáját PBS oldattal, RWP-nel vagy hőinaktivált RWP-nel (RWP^H) kezeltük.

Az egereket 3 órával a kezelések után túlaltattuk, a szemüket eltávolítottuk, és szövettani metszeteket készítettünk. A Giemsa-val festett szöveti mintákat mikroszkóppal vizsgáltuk. A képek 5-6 egérből álló csoportok kötőhártyájának metszeteit reprezentálják. Nagyítás: 100x.

A X+XO együttadása a RWP^H-nel viszont megnövelte a degranulált hízósejtek számát.

Habár a hízósejtek száma a kötőhártyában hasonló volt minden kezelt csoportban, a hízósejtek degranulációja lényegesen magasabb volt az oxidatív stresszt indukáló kezelések után (RWP, RWP^H+[X+XO]; II. Táblázat). A gyulladásos sejtek beáramlását a kötőhártyába 48 órával a RWP kezelés után vizsgáltuk. A RWP kezelés a gyulladásos sejtek, elsődlegesen az eozinofilek, erőteljes infiltrációját váltotta ki (17. ábra). Ezzel ellentétben, kisebb volt a gyulladásos sejtek beáramlása mind a RWP^H, mind a Tironnal előkezelt RWP expozíció esetében (17. ábra). A RWP^H-nel és a X+XO-zal történő szimultán kezelés visszaállította a beáramló eozinofilek számát a kötőhártyában a RWP által indukált szintre (17. ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a kötőhártyában a RWP-indukálta ROS hozzájárul a hízósejtek degranulációjához és a gyulladásos sejtek toborzásához. A kötőhártyában kialakuló oxidatív stressz mértéke szoros összefüggést mutat a klinikai tünetek súlyosságával.

17. ábra. A parlagfű pollen (RWP) által indukált oxidatív stressz elősegíti a gyulladásos sejtek bevándorlását a kötőhártyába

Az egerek kötőhártyáját PBS oldattal, RWP-nel, hőinaktivált RWP-nel (RWP^H), RWP^H+X+XO-dal, vagy X+XO-dal kezeltük. Az egereket 48 órával a kezelések után túlaltattuk, a szemüket eltávolítottuk, és szövettani metszeteket készítettünk. A hematoxilinnal és eozinnal festett szöveti mintákat mikroszkóppal vizsgáltuk. A képek 6 egérből álló csoportok kötőhártyájának metszeteit reprezentálják. Nagyítás: 100x.

Ebben a vizsgálatban igazoltuk, hogy az intakt pollenszemek is képesek szabadgyököket termelni, oxidáz enzimek működése révén. Kimutattuk, hogy ezek a pollen oxidázok, amelyek elsődlegesen O₂^•--t generálnak, a NADH-t és a NADPH-t is használhatják elektron donorként, szemben a fagociták hasonló oxidázaival, amelyeknek elsődlegesen a NADPH a szubsztrátja [207]. Fiziológiás pH körülmények között a O2

•

-, negatív töltése miatt-, nehezen tud átjutni membránokon [210]. Kimutattuk azonban, hogy a pollen NAD(P)H oxidázok által termelt O₂^•- rövid idő alatt H₂O₂-dá dizmutálódik, amely könnyedén penetrálja a membránokat, így gyorsan megemeli az intracelluláris ROS szintjét tenyésztett hámsejtekben és az egerek kötőhártyájában is.

Jól ismert a hízósejtek központi szerepe az allergiás válaszok kialakulásában [214].

Korábbi vizsgálatok szerint O2•

vagy H2O2 expozíció hisztamin felszabadulását indukálja patkány peritoneális hízósejtekben in vitro körülmények között [215]. Más tanulmányokban kimutatták, hogy a fokozott oxidatív stressz növeli, míg az antioxidánsok jelentősen csökkentik a hízósejt degranulációt [216, 217]. A szisztémás hipoxia, szintén a hízósejtek degranulációját okozza, oxidatív „burst” indukálásával, amelyet gátolni lehet liponsav antioxidáns hozzáadásával [218]. Összhangban ezekkel a korábbi megfigyelésekkel, eredményeink szerint a pollen NAD(P)H oxidázok által indukált oxidatív stressz is hozzájárulhat a hízósejtek aktiválódásához a kötőhártyában. Ha hőkezeléssel, vagy Tiron kezeléssel elimináltuk a pollenszemek szabadgyök termelését, jelentősen csökkentek a pollenszemek által kiváltott allergiás reakció azonnali tünetei egerekben. Egy későbbi vizsgálatunkban azt találtuk, hogy patkány hízósejtekben (RBL-2H3 sejtvonal) RWE-tal történő kezelés után fokozódik a mitokondriális H₂O2 termelés [219]. A fokozott mitokondriális ROS kibocsátás hisztamin és szerotonin kiszabadulását eredményezi a sejtekből, függetlenül az IgE ellenanyagok által közvetített szignáloktól. Ez azt jelenti, hogy a pollen NAD(P)H oxidázok által kiváltott oxidatív stressz mitokondriális működési zavarhoz vezethet, és a hízósejtek aktiválódását eredményezheti függetlenül az adaptív immunválasztól.

Azonosítottuk, hogy a jelenség hátterében protein kináz C-δ aktiválódása, valamint a szekretoros vezikulák H⁺-ATPáz aktivitásának gátlása áll [219].

Jelen megfigyeléseink szerint a gyulladásos sejtek infiltrációja a kötőhártyába sokkal kisebb mértékű, ha az expozíció során a pollenszemek szabadgyök termelése gátolt.

Eredményeink arra utalnak, hogy pollenszemek NAD(P)H oxidázainak specifikus gátlása, vagy a könny antioxidáns kapacitásának fokozása új terápiás lehetőség lehet az allergiás kötőhártya-gyulladás megelőzésében, illetve kezelésében.

5.3. A szubpollen partikulákban jelen vannak az allergén proteinek és a NAD(P)H