A PCR termékek restrikciós emésztése

Az amplifikációt követő restrikciós emésztést az adott polimorfizmusra specifikus restrikciós enzimmel végeztük, ismert genotípusú kontrollok használata mellett. Az emésztési reakció minden esetben a gyártó által ajánlott standard körülmények közöttzajlott. A reakcióelegyek összetételeit a 9. táblázat tartalmazza.(A feltüntetett enzimek és a pufferek gyártója a Thermo Fisher Scientific).

9. táblázat

A restrikciós emésztéshez használt reakcióelegyek összetétele

Polimorfizmus Restrikciós endonukleáz Puffer Végtérfogat név koncentráció név koncentráció

CFH c.-331 HphI 1,6U/µl Buffer B 3x 5 µl

CFH p.Y402H TasI 1,2U/µl Buffer B 3x 5 µl

CFH p.E936D DdeI 1,2U/µl Buffer Tango 3x 5 µl

Az enzimatikus emésztés során a restrikciós elegyet 1:2 arányban adtuk a PCR termékekhez (5µl restrikciós reakcióelegy 10µl PCR termékhez). Az emésztés 37°C-on zajlott egész éjszakán át. A restrikciós emésztést követően a keletkező fragmentumok elválasztására 3%-os (c.-331 esetében 2%-os) agaróz gélelektroforézist alkalmaztunk, a már korábban leírt módszer szerint (4.5.2. fejezet). Az egyes személyek genotípusát a restrikciós emésztés után keletkezett fragmentumok alapján határoztuk meg a 10. táblázat szerint.

10. táblázat

Az egyes polimorfizmusok genotípusai a restrikciós emésztések után keletkezett hasítási termékek alapján

41 4.7. Valós idejű PCR (Real Time PCR)

A CFH gén p.V62I polimorfizmusának real-time PCR-rel történő genotipizálása 10µl végtérfogatú reakcióelegyben zajlott. A reakcióelegy összetétele a következő volt:

8-10ng genomiális DNS; 1x Maxima Probe qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific), mely tartalmazza a dNTP-t, Maxima HotStart Taq DNS polimeráz enzimet, a működéséhez szükséges puffert és a ROX festéket; 1x Life Technologies C_2530382_10 kit, mely tartalmazza a genotipizáláshoz szükséges primereket és próbákat. A DNS amplifikáció Qiagen Rotor-Gene Q real-time PCR készülékben zajlott. A PCR reakció során alkalmazott kezdeti denaturáció 95°C-on 15 percig zajlott, majd 40 termociklus követte: 92°C 15 másodpercig és 60°C 1 percig. A detektálás 567 nm excitációs és 591 nm emisszós hullámhosszon történt, minden ciklusban a 60°C-os szakaszok alatt.

4.8. Multiplex ligáció-függő próba amplifikáció (MLPA)

A kópiaszám-eltérések detektálására multiplex ligáció-függő próba amplifikációt végeztünk. A reakciókhoz az MRC-Holland (Amsterdam, Hollandia) próbamixeit használtuk: a SALSA MLPA P236-A3 próbamix a CFH és CFHR gének (CFHR1, CFHR2, CFHR3, CFHR5) kromoszómális régiójában jelenlévő deléciók és duplikációk detektálására alkalmas, míg a P296-A1 mix a CFI és CD46 gének kódoló régióira specifikus próbákat tartalmaz. A denaturálási, hibridizálási, ligálási és PCR reakciók körülményei megegyeztek a gyártó által előírtakkal. A kapilláris elektroforézis Applied Biosystems 3130xl típusú genetikai analizátorban zajlott. Az adatok kiértékelését a Coffalyser MLPA (MRC-Holland) programmal végeztük, mely során az adott allél kontrollhoz viszonyított relatív kópiaszámát vizsgáltuk.

4.9. Az aktivációs utak és komplementfehérjék mérése

Az aktivációs utak és komplementfehérjék mérése rutin diagnosztikai vizsgálatok keretében történt, melyeket laboratóriumi asszisztens munkatársak végezetek a korábban közölt leírások szerint (132). A klasszikus út összaktivitása hemolitikus módszerrel, az alternatív út összaktivitása a Wieslab Compl AP330 kit-tel (Euro Diagnostica, Malmö, Svédország) lett meghatározva. A H-faktor szint mérése szendvics ELISA módszerrel, a C3 fehérjeszint mérése kereskedelmi forgalomból származó Tina-quant C3c. ver.2 immunturbidimetriás teszttel (Roche Diagnostics, Basel, Svájc), a C4, B-faktor és I-faktor

42

szintjének meghatározása radiális immundiffúziós módszerrel (133), a H-faktor elleni autantitestek mérése pedig direkt ELISA-val történt. Az ADAMTS13 aktivitás meghatározása FRET-VWF-73 fluoreszcens quenching szubsztrát hasításából eredő fluoreszcencia mérésén alapuló módszerrel történt (134).

4.10. Allélspecifikus H-faktor szint mérése

A H-faktor p.402Y illetve p.402H alléljaira specifikus ELISA módszer beállításához a korábban leírt (135) metodikát optimalizáltuk. A módszerrel a polimorfizmusra heterozigóta személyekben mértük a p.402-es pozícióban tirozint (Y) és a hisztidint (H) tartalmazó H-faktor (és a CFHL-1) fehérjék szintjét és egymáshoz viszonyított arányát.

Az allélspecifikus ELISA végleges beállítása a következő volt: a Nunc Immuno MaxiSorp ELISA lemezek fedését a mérést megelőző napon végeztük birka anti-humán H-faktor poliklonális ellenanyaggal (Binding Site, Birmingham, UK) 8,6g/ml koncentrációban, 100µl/well térfogatban, bikarbonát pufferben, majd egy éjszakán át, 4°C-on inkubáltuk a lemezeket. Másnap minden inkubálás 1 órán át szobahőmérsékleten zajlott, ennek leteltével a kötetlen részecskéket mosással távolítottuk el a lemezről:

egymást követően négyszer 200µl/well mosó pufferrel mostuk a lemezeket, majd 100µl/well blokkoló pufferrelblokkoltunk. A szérummintákat hígító pufferrel 1:2000 arányban hígítottuk, majd a lemezre 100-100µl-t mértünk 2 párhuzamosban. Ezután p.402Y-specifikus (0,1mg/L) vagy p.402H-specifikus (0,25mg/L) monoklonális antitesteket adtunk a lemezekhez. Az antitesteket a módszert kidolgozó Paul Morgan (Cardiff Egyetem, UK) bocsátotta rendelkezésünkre. Inkubálás és újabb mosás után kecske anti-egér IgG-tormaperoxidáz konjugátumot (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, USA) adtunk a mintákhoz, amit 1:12000 arányban hígítottunk. Végül 100-100μl használatra kész TMB (3,3,5,5-tetrametil-benzidin) – perioxidot (TMB Single Solution, Life Technologies) mértünk a lemezekhez, majd az enzimatikus reakciót 50μl 4M-os kénsavval állítottuk le. Az optikai denzitást 450nm-en mértük.

Kalibrációs standardok készítéséhez olyan p.402H és p.402Y homozigóta genotípusú egyedek szérummmintáját kevertük össze 1:1 arányban, akikben előzőleg a H-faktor szintet megmértük, és genotípusukat PCR-RFLP-vel megállapítottuk. Hígító pufferben felező hígítással 15,62 mg/ml-2000 mg/ml nominális koncentrációjú standard mintákat készítettünk, ezeket aliquotokra osztottuk, -80°C-on tároltuk, és minden lemezhez 1-1

43

aliquotot felolvasztottunk. Kontrollként négy beteg szérummintáját használtuk, amiket előzetesen a kereskedelmi forgalomban kapható HK353 ELISA kit (Hycult Biotech, Uden, Hollandia) felhasználásával lemértünk, betartva a gyártó előírásait. A kontroll mintákat a kalibrációs standardokhoz hasonlóan aliquotokra osztottuk, -80°C-on tároltuk, és minden lemezhez 1-1 aliquotot felolvasztottunk és lemértünk. A kalibrációs standardokat két párhuzamosban használtuk minden ELISA lemezen, ezekből átlag abszorbancia értékeket számoltunk. A standard görbét nonlineáris regressziós modellel illesztettük a kalibrációs pontokhoz. A lemezeket akkor értékeltük ki, ha minden kalibrációs pont és a kontroll minták is teljesítették az elfogadási kritériumokat: a kalibrációs görbéből visszaszámolt koncentráció értéke a nominális koncentrációérték

os tartományában volt, és a két párhuzamos mérés variációs koefficiense ±20%-on belül volt.

4.11. H-faktor hemolitikus teszt

A H-faktor hemolitikus tesztet Sanchez- Corral és munkatársai által leírt módszer szerint végeztük (136). A mérés során 100μl AP-CFTD (5mM nátrium-barbitál pH 7,4, 150mM NaCl, 7mM MgCl2, 10mM EGTA) pufferben hígított szérumot 100μl birka vörösvértesthez mértünk (1×108 sejt/ml) és 30 percig, 37°C-on inkubáltuk. A reakció leállításához az elegyhez 150μl hideg VBS-EDTA (2,5mM barbital, 1,5mM Na-barbital, 144mM NaCl, 2mM EDTA, pH 7,2–7,4) puffert adtunk, majd a mintákat 2000 rpm-en, 10 percig centrifugáltuk. A vörösvértestekből történő hemoglobin felszabadulás méréséhez 414 nm-es hullámhosszon olvastuk le az abszorbanciát. A lízis mértékét úgy számítottuk ki, hogy az abszorbancia értékből kivontuk a blank értékét, és elosztottuk a pozitív kontrollal (a vörösvértestekhez desztillált vizet adtunk), ami a 100%-os lízisnek felel meg.

4.12. Statisztikai módszerek

A statisztikai analíziseket a Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, California, USA, www.graphpad.com) statisztikai szoftverrel végeztük. A hemolitikus tesztben mért eredmények kontroll mintához hasonlítását Dunnet-féle post hoc teszttel kiegészített egyszempontos, paraméteres ANOVA-val végeztük. A H3 és nem H3 hordozó személyek

44

ELISA eredményeinek összehasonlításához Mann-Whitney U-tesztet használtunk. A próbák eredményét p<0,05 értékek esetén tekintettük szignifikánsnak.

A CD46 gén polimorfizmusai közötti kapcsoltsági egyensúlytalanságot (LD) a Haploview 4.2 szoftvert használva (137) számoltuk ki, az International HapMap Project (www.hapmap.org) észak- és nyugat-európai kaukázusi populációjának genotípus adatai alapján.

4.13. In silico predikciók

Az újonnan azonosított mutációk lehetséges funkcionális hatásának in silico predikcióját a PolyPhen (version2) (138) (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), a SIFT

(139) (http://sift.jcvi.org/), a PROVEAN (140)

(http://provean.jcvi.org/genome_submit_2.php) és a MutationTaster (141) (http://mutationtaster.org) online predikciós szoftverekkel végeztük.

45 5. Eredmények

A bemutatott eredmények a Semmelweis Egyetem III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratóriumában folyó komplement-diagnosztikai vizsgálatoknak és a 2008-ban indult genetikai módszerbeállításoknak köszönhetőek, ebbe a munkába 2011 őszén kapcsolódtam be. A legtöbb bemutatott beteg kezelését, adataik gyűjtését és feldolgozását a Semmelweis Egyetem I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika, a Transzplantációs és Sebészeti Klinika, a Fővárosi Szent István és Szent László Kórház Hematológiai (Csontvelőtranszplantációs és Aferezis) osztály munkatársai valamint a bécsi Universitätsklinik für Kinder- und Jugendheilkunde és a Skopjei University Children's Hospital munkatársai végezték. A doktori értekezés alapjául szolgáló egyik közlemény eredményei Anna Blom munkacsoportjával (Medical Protein Chemistry Research Group, Lund University, Malmö, Svédország) együttműködésben jöttek létre.

5.1. Az aHUS betegek klinikai jellemzői és laboratóriumi paraméterei 5.1.1. A betegség lefolyásának vizsgálata

A betegség lefolyását 29 aHUS betegben vizsgáltuk, kórházi dokumentációkból gyűjtött adatok alapján. A betegség megjelenésére, kezelésére és kimenetelére vonatkozó részletes adatok a 11. táblázatban láthatók. Az aHUS első megjelenése 1 napos kortól 60 éves korig terjedt (medián 13,5) (11. ábra), jellemzően gyermekkorban (<18 év, 53,3%) jelentkezett, a legtöbb betegnél már 2 éves kor előtt (30%).

11. ábra

Az vizsgált betegek életkora az aHUS első megjelenésekor

46

A másik jellemző életkor a fiatal felnőttkor volt, a betegek 36,7%-ának 19-30 év közötti életkorban volt az első epizódja, nők esetében ez gyakran az első terhességet vagy szülést jelentette.

A betegség elsődleges kezelése minden esetben plazmaterápia volt, 19 beteg szorult dialízisre (65,5%). Az első epizód során három, 2 év alatti beteg hunyt el (10,34%).

Tizenhárom betegben (44,83%) már az első epizód során végállapotú veseelégtelenség alakult ki (ESRD), azóta közülük egy elhunyt, a többi beteg dialízis kezelésre szorul. Az első epizód során 4 betegnél (13,79%) alakult ki krónikus veseelégtelenség, itt vesepótló kezelésre nem volt szükség, jelenleg remisszióban vannak. Összesen 9 beteg (31,03%) az első epizód után vesekárosodás nélkül került teljes remisszióba.

A követés ideje alatt további 3 beteg exitált, így összesen 6 beteg hunyt el (20,69%).

13 betegnek (44,82%) volt egy vagy több relapszusa, 5 (17,2%) betegnek volt legalább egy transzplantációja, egyikük elhunyt, a többi beteg transzplantáció után is dialízisre szorul a graft nem megfelelő működése miatt. Jelenleg összesen 12 beteg (41,38%) végállapotú veseelégtelenség miatt tartós dialízisre szorul, 11 beteg (37,93%) pedig veseelégtelenség nélkülteljes remisszióban van, közülük öten eculizumab kezelés mellett.

11. táblázat

Az aHUS betegek klinikai jellemzői

Regiszer kód Nem (F/N) Életkor az 1.epizódkor Epizódok száma Dialízis Transzplantá- ciók száma Eculizumab Kimenetel az első epizód után Jelenlegi státusz Követés (év)

HUN12 N 0,5 5 + - - teljes remisszió exit 2

47

Regiszer kód Nem (F/N) Életkor az 1.epizódkor Epizódok száma Dialízis Transzplantá- ciók száma Eculizumab Kimenetel az első epizód után Jelenlegi státusz Követés (év)

HUN421 N 2,5 5 + - + teljes remisszió remisszió eculizumab mellett 19

HUN499 F 0 1 - - + remisszió eculizumab

mellett

exit más okból 0,5

HUN528 F 20 2 + - - ESRD dialízisre szorul 9

HUN555 N 46 1 + - - ESRD dialízisre szorul 1

HUN579 F 6 1 - - - teljes remisszió remisszió 1

HUN599 N 19 1 + - - ESRD dialízisre szorul 1

HUN620 N 9 1 - - + CKD eculizumab kezelés alatt 1

HUN649 N 27 4 + 3 - ESRD remisszó (krónikus allograft

nefropátiával) 15

HUN680 F 0 4 N/D - + N/D eculizumab kezelés alatt 11

HUN737 N 12 1 - - + CKD remisszió eculizumab mellett 0,5

Rövidítések: ESRD: végállapotú veseelégtelenség (end-stage renal disease), CKD: krónikus veseelégtelenség (chronic kidney disease), MODS: többszervi elégtelenség (multiple organ dysfunction

syndrome)

A betegség kimenetelét az első epizód után, valamint a jelenlegi státuszban értékeltük (12. ábra). Külön értékeltük az eculizumab kezelésben nem részesült (12. ábra, A, C) és az eculizumab kezelésben részesült betegek adatait (12. ábra, B,D). Az értékeléshez 4 korcsoportot határoztunk meg: 2 év alatti csecsemők, gyermekek 2-18 év között, fiatal felnőttek 19-40 év között és 40 év felettiek. A 2 éves kor alatti korosztályban volta legsúlyosabb a betegség kimenetele, mind a 6 elhunyt csecsemő volt, és csak 3 beteg élt túl. A mortalitási ráta 66,67% ebben a korosztályban, az összes betegre vonatkoztatva pedig 20,69%. Az eculizumab kezelésben részesült betegek prognózisa jobb, mint a kezelésben nem részesült betegeké. Bár egyelőre kevés beteg kaphatott célzott komplement-terápiát, és a kezelések minden esetben jelenleg is tartanak, az eddigi eredmények alapján hatékonynak bizonyult (HUN499 egyéb ok miatt hunyt el, a többi beteg remisszióban van).

48 12. ábra

A betegség kimenetele az első epizód után és a jelenlegi státuszban (követés) két éves kor alatti, a 2-18 év közötti, a 19-40 év közötti, és a 41-60 év közötti betegekben.

A korosztályok a betegség első megjelenését jelölik. A: A betegség kimenetele 23 eculizumab kezelésben nem részesült betegben, az első epizód után; B: A betegség kimenetele 6 eculizumab

kezelésben részesült betegben, az első epizód után; C: A 23 eculizumab kezelésben nem részesült beteg jelenlegi státusza; D: A 6 eculizumab kezelésben részesült beteg jelenlegi

státusza. Kék: elhunyt, Piros: végállapotú veseelégtelenség (ESRD), Sárga: krónikus veseelégtelenség (CKD), Zöld: remisszió, Fehér (N/D): nincs adat

49

5.1.2. A betegek komplementprofiljának vizsgálata

A 12. táblázatban foglaltam össze a betegekben mért komplementprofilt akut betegségszakaszból és/vagy remissziós mintából mérve.

12. táblázat

Az aHUS betegek komplementprofilja akut fázisban és remisszióban

Beteg azonosító

Komplementprofil akut fázisban Komplementprofil remisszióban AP %

*: szubakut minta: plazmaferezis befejezése után, hematológiailag remisszióban

# :Eculizumab kezelés alatti minta. Kiemelt értékek: normál tartomány alatt.

Rövidítések: AP: alternatív út aktivitás, IF: I-faktor fehérjeszint, BF: B-faktor fehérjeszint

Az aHUS betegek komplementprofiljában akut fázisban a legtöbb esetben fokozott komplement-aktiváció és konszumpció figyelhető meg: alacsony alternatív út aktivitás a rendelkezésre álló minták 69,23%-ában, alacsony C3 szint 84,62%-ban, alacsony I-faktor

50

szint 53,85%-ban, alacsony H-faktor szint ban, alacsony B-faktor szint 69,23%-ban volt jellemző (13 mintá69,23%-ban, a komplementgátló terápia alatti mintákat kizárva).

Remisszióban több eltérés helyreállt, azonban sok esetben megfigyelhető egyes komponensnek tartósan alacsony szintje, ami mutáció(k) hatására utal az alternatív út komponenseiben: alacsony alternatív út aktivitás a rendelkezésre álló minták 47,37%-ában, alacsony C3 szint 63,16%-ban, alacsony I-faktor szint 21,05%-ban, alacsony H-faktor szint 15,79%-ban, alacsony B-H-faktor szint 26,32%-ban volt jellemző (19 mintában, a komplementgátló terápia alatti mintákat kizárva).

5.2. Az aHUS betegek genetikai vizsgálata 5.2.1. A szekvenálási reakciók beállítása 5.2.1.1. PCR primerek tervezése

A hat vizsgált gén (CFH, CFI, CD46, C3, CFB, THBD) összesen 109 exont tartalmaz. Az amplifikáláshoz a legtöbb esetben egy exonra egy primerpárt terveztünk, ám ha két vagy több egymás melletti exon mérete és távolsága lehetővé tette, úgy egy közös terméket amplifikáltunk azokról, így összesen 66 amplikont kaptunk. A primerek egy részét irodalmi adatok alapján rendeltük meg, illetve a Primer Premier program segítségével terveztük meg.

5.2.1.2. A PCR reakciók optimalizálása

A 10µl végtérfogatú PCR reakcióelegy összetétele minden reakció esetében 2mM dNTP, 5x Promega GoTaq Flexi puffer, 5 U/µl Promega GoTaq, 10-10µM forward és reverse primer volt, ehhez különböző mennyiségű Q-oldatot és MgCl2 oldatot adtunk. A Q-oldat egy glicerint tartalmazó oldat, amely a DNS olvadáspontjának csökkentésével elősegíti a GC-gazdag régiók amplifikálását, véd a másodlagos struktúrák kialakulása ellen és növeli az enzim stabilitását. A MgCl2 a DNS polimeráz kofaktora, ami növeli az amplifikáció hatékonyságát. Összesen 12 féle reakcióelegyet próbáltunk ki, ezek összetétele a 13. táblázatban látható (mix1-12), az optimalizálás után összesen 8 féle reakcióelegyet használtunk (4. táblázat).

51 13. táblázat

PCR reakcióelegyek (mixek) Q-oldat és MgCl2 végkoncentrációja (hozzáadott mennyiség) Mix száma Q-oldat MgCl2

A PCR reakciók optimalizálásához több reakcióelegyet is teszteltünk párhuzamosan, majd agaróz gélelektroforézissel láthatóvá tettük a keletkezett termékeket, és ezek mennyisége alapján állapítottunk meg az optimális összetételt. A beállítás akkor volt sikeres, ha az elektroforetikus kép alapján nagy mennyiségben keletkezett specifikus termék, és nem volt aspecifikus termék. Ha a kapott termékek nem voltak megfelelőek, további reakcióelegyeket is teszteltünk. A reakcióelegy összetételén kívül meghatároztuk az optimális annealing hőmérsékletet, hogy elkerüljük a primerek nem megfelelő kötődését a denaturált egyszálú DNS-hez. Az annealing hőmérséklete kritikus a reakcióban, 50-65°C között változik, ha túl alacsony, aspecifikus kötődések jöhetnek létre, ezáltal aspecifikus termékek képződhetnek; ha túl magas, akkor nem fog megfelelően hibridizálni a primer. Az optimális hőmérséklet általában 3-5°C-kal van a primerek olvadási hőmérséklete alatt. A 13. ábrán a H-faktor scr20 domén PCR reakciójának optimalizásása látható, ahol a mixeket és az annealing hőmérsékleteket kombinálva teszteltük.

13. ábra

PCR termékek négyféle annealing hőmérséklet és négyféle reakcióelegy alkalmazásával

52 5.2.1.3. Szekvenáló primerek tervezése

A reakció nagyobb specificitása miatt a PCR reakciókat és a szekvenálást a legtöbb esetben két különböző primerpárral végeztük. Bár a leghosszabb amplifikált PCR termék 2499 bp volt, a szekvenálási reakciók kb. 600-800 bp-ig értékelhetők, így a hosszabb termékeken több szekvenáló primert alkalmaztunk, és a szekvenciákat szoftveresen illesztettük össze. A 14. ábrán a THBD génről amplifikált PCR termék és az erről 8 különböző szekvenáló primerrel leolvasható régiók elhelyezkedése látható. Az illesztés után a szekvencia a kódoló régió teljes szakaszát legalább kétszeresen lefedi.

14. ábra

A THBD génről amplifikált PCR termék és a szekvenáló primerekkel leolvasható régiók elhelyezkedése

---- PCR termék; ….:szekvenálási termék, : forward primer, : reverse primer

5.2.1.4. A kromatogrammok feldolgozása

A nyers szekvenciafile-okat CLC DNA Workbench 6 programmal dolgoztuk fel, ami a vizsgált minta bázissorendjét a referencia szekvenciához viszonyítva jeleníti meg. A másodlagos csúcsok kiértékelésére 40%-os küszöbértéket állítottunk be, azaz a fő csúcs 40%-át elérő kisebb csúcsot a program az adott variációra heterozigótának értékeli (15.

ábra).

53 15. ábra

Egy MCP mutáció (p.G259V) kromatogrammja a referencia szekvenciához illesztve a CLC feldolgozás után.

A felső sorban a referencia szekvencia részlete látható, alatta a vizsgált DNS kétirányú szekvenálásából összeillesztett szekvencia részlete, pirossal a reverse, zölddel pedig a

forward szekvencia részlete. A heterozigóta mutációt két csúcs (G és T) jelzi.

5.2.2. Az aHUS betegek genetikai vizsgálatainak eredményei

A vizsgált gének teljes kódoló régiójának szekvenálását 29 aHUS betegben végeztük el. Huszonhárom betegben összesen 27, feltételezhetően betegségokozó variációt találtunk, 6 beteg esetében nem találtunk mutációt. Összesen 15 korábban már leírt és 12 új mutációt találtunk ezekben a betegekben. A mutációk részletes jellemzése a 14.

táblázatban látható.

Továbbá azonosítottunk egy ritka C3 variációt (p.D1457H), ami a dbSNP adatbázis (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ ) rs113742728 azonosítójú polimorfizmusának felel meg.

Ezt a ritka variációt eddig nem írták le aHUS betegekben, és az ESP (NHLBI Exome Sequencing Project) adatbázisa (EVS, Exome Variant Server, http://evs.gs.washington.edu/EVS/) szerint nem ismert európai-amerikai populációban sem, viszont megtalálták afrikai-amerikaiakban 0,34%-os frekvenciával. Mivel az általunk vizsgált beteg is afrikai származású, ezt a variációt polimorfizmusnak tekintettük, és a mutációs listából kizártuk. Egy további C3 variációt találtunk az 5’-UTR régióban (c.-44C>T), ami nem található meg az EVS és a HGMD (Human Gene Mutation Database, http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php) adatbázisokban. Ez a variáció nem okoz

54

fehérjében Változás a c.DNS-ben Exon Hivatkozás Beteg azonosító CFH

p.T1216del c.3646_3648delACA 23 (154) HUN12

CFI

p.I1157T c.3470T>C 27 (124, 159) HUN420, HUN421

*Homozigóta mutáció

A legtöbb mutációt a CFH génben találtuk: 13 mutációt (48,1%) 14 betegben; 4-4 mutációt (14,8-14,8%) találtunk a CD46 génben 4 betegben és a CFI génben 3 betegben, 3-3 mutációt (11,1-11,1%) találtunk a CFB génben 3 betegben és a C3 génben 4 betegben.

Tizenkét olyan új mutációt azonosítottunk a vizsgált komplement génekben, amiket korábban nem írtak le aHUS betegekben, és egészséges személyekben sem ismert az EVS

55

(Exome Sequencing Project, ESP) adatbázisa, a HGMD adatbázisa valamint az 1000Genom Projekt adatbázisa (http://www.1000genomes.org/) alapján.

Egy beteg (HUN12) a genetikai vizsgálatok kezdetén már elhunyt, és nem állt rendelkezésünkre EDTA-val alvadásgátolt vérmintája. Bár kis mennyiségű DNS-t izolálni tudtunk a korábban fagyasztott szérummintájából, ez csak egy, a H-faktor scr20-as doménjét kódoló 23-scr20-as exon szekvenálására volt elegendő (a szülők szekvenálása alapján ebben az exonban volt várható mutáció). A többi feltüntetett genetikai adatot a családtagok szekvenálásából következtettük ki.

A szekvenálási reakciók során kapott kromatogrammokon számos polimorfizmus látható, így aminosavcserét okozó SNP-k és olyan polimorfizmusok is, amik aHUS rizikóként ismert haplotípusok részét képezik. Az rs3753394 (-331C/T), rs800292 (V62I), rs1061170 (Y402H), rs3753396 (Q672Q) és rs1065489 (E936D) polimorfizmusok genotípusából valószínűsíthető (5. ábra) a H-faktor haplotípusa.

Összesen 13 beteg (44,8%) hordozza a H-faktor H3 aHUS rizikó haplotípusát, 11 beteg heterozigóta formában, 2 beteg homozigóta formában. A H3 rizikó haplotípus frekvenciája a betegpopulációban 0,259 volt.

Az MCPGGAAC aHUS rizkó haplotípus az rs2796267, rs2796268, rs1962149, rs859705 és rs7144 polimorfizmusok ritka alléljeit tartalmazza. Mivel az rs859705 és az rs7144 genotípusaira a szekvenálásból nem kaptunk adatokat, az International HapMap Project (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) adatait felhasználva kapcsoltsági analízist végeztünk, hogy meghatározzuk a kapcsoltsági egyensúlytalanságot (linkage disequilibrium, LD) az általunk szekvenálással meghatározott polimorfizmusok és további, IPD vagy aHUS rizikóként ismert CD46 variációk között (16. ábra). Az elemzés alapján az rs859705 és az rs7144 polimorfizmusok szorosan kapcsoltak az rs1962149 polimorfizmushoz (r²=1, D’=1), így nagy biztonsággal kimondható a MCP rizikó haplotípus hordozása a három, kódoló régióra eső, szekvenálással megállapított polimorfizmus alapján (rs2796267, rs2796268, rs1962149). A három polimorfizmus genotípusaiból kikövetkeztethető (2. táblázat), hogy összesen 26 beteg (89,6%) hordozza az MCPGGAAC rizikó haplotípust, 17 beteg heterozigóta, 8 beteg homozigóta formában, egy beteg hetero vagy homozigóta formában (HUN12, nem szekvenálható). Az MCPGGAAC aHUS rizikó haplotípus frekvenciája (HUN12-t kizárva) 0,589 volt, míg a gyakori MCPAAGGT haplotípus 0,321 frekvenciával fordult elő.

56 16. ábra

A vizsgált MCP polimorfizmusok közötti páronkénti kapcsoltság, a Hapmap CEU populáció adatait használva.

A négyzetek színe a négyzet két felső oldala irányában lévő két SNP közötti kapcsoltságot jellemző r² értéket jelöli szürkeskálán, ahol a fehér szín az r2=0, a szürke

az 0 < r²< 1 és a fekete az r² = 1. A négyzetekben lévő számok a D’ értéket jelölik %-ban kifejezve, míg a szám nélküli négyzetek D’ értéke 1,0

.

az 0 < r²< 1 és a fekete az r² = 1. A négyzetekben lévő számok a D’ értéket jelölik %-ban kifejezve, míg a szám nélküli négyzetek D’ értéke 1,0

.

In document A komplement alternatív út regulációjának szerepe hemolitikus urémiás szindrómában (Pldal 41-0)