6. MEGBESZÉLÉS
6.5. A PARP- GÁTLÁS KARDIOVASZKULÁRIS PROTEKTÍV HATÁSÁNAK MOLEKULÁRIS ÉS SZUBCELLULÁRIS ASPEKTUSAI 142
6.5.5. A PARP-gátlás hatása a sejt energetikai jellemzőire, valamint a mitokondrium
A sejtek sorsát befolyásoló válaszreakciók többsége a mitokondriumra konvergál és direkt, vagy indirekt módon befolyásolja azok struktúráját és funkcióját [307]. Azonban akut és krónikus stressz szituációkban eltérő mechanizmusok lehetnek a dominánsak. A Berger által leírt sejthalál, a „parthanatos” akut stressz hatására következik be. A DNS károsodás következtében a PARP-1 enzim jelentős aktivációja követezik, mely a sejt NAD+ tartalmának drámai csökkenéséhez és metabolikus katasztrófához, valamint nekrotikus sejthalálhoz vezet [308].
Később kerültek leírásra az akceptor fehérjékről levált PAR polimerek szignalizációs hatásai. A sejtmagból a mitokondriumba transzlokálódva elindítják az AIF kibocsátását, mely kromatin kondenzációt indukál. Vizsgálatok igazolták az emelkedett intracelluláris Ca2+ koncentráció és a JNK aktiválódás szerepét is ezen folyamatban, mivel elősegítik az OMM permeabilizációját [309]. Vizsgálataink során hipertenzív állatok aorta és carotis falában az AIF nukleáris transzlokációja figyelhető meg konfokális mikroszkóppal (32.
és 37. ábra). A központi idegrendszerben, a dorzális hippocampusban pedig az apoptotikus (TUNEL+) piramissejtek számának emelkedését észleltük ezen állatokban (40. ábra). PARP-1 enzim gátlása L-2286 alkalmazásával jelentősen gátolta az AIF transzlokációt, valamint ezzel párhuzamosan az apoptotikus sejthalált is. A PARP-gátlás ezen védő hatásának hátterében több folyamat is állhat. Először is az energia konzerváló hatás és a mitokondriális védő hatás következtében mérséklődött másodlagos szabadgyök termelődés gátlásán keresztül mediálódhat ez a hatás [90, 94]. Ezt a hatást támasztja alá az ex vivo szívperfúziós kísérletekben észlelt pozitív energetikai hatás is. A reperfúzió során ugyanis a magas energiájú foszfát szintek (ATP és CrP) PARP-gátló kezelés mellett gyorsabban és komplettebb módon álltak helyre (6. ábra). Emellett ISO-indukálta szívelégtelenség modellben a kezeletlen posztinfarktusos állatokhoz képest az L-2286 kezelt állatok mitokondriumaiban a légzési lánc fehérjéinek aktivitása is magasabb volt (8. ábra). A mitokondriális légzési lánc (ETC) aktivitása pedig ismerten fordítottan arányos az általa termelt szabad gyökök mennyiségével [310]. Alapvető kérdés, hogy egy
nukleáris faktor, mint a PARP enzim, hogyan képes a mitokondriumban hatást kifejteni.
Erre utalóan munkacsoportunk már korán kimutatta a PARP-gátlás direkt mitokondriális védő hatását [94]. Ennek hátterében más munkacsoportok a PAR jelenlétét igazolták, amit Amati és csoportja eredményei szerint magának a PARP-1 enzimnek a sejtmagból a mitokondriális mátrixba történő átjutása magyaráz a mitofilinnel való interakció által [303].
A csökkent szabadgyök termelődés következtében az oxidatív sejtkárosodás foka is egyértelműen mérséklődött. Csökkent a lipoproteinek, a lipidek és a DNS károsodása az érfalban, az agyban és a szívizomzatban (31., 36. és 39. ábra). Különösen az idegszövetben – mely nagy mennyiségben tartalmaz telítetlen zsírsavakat – a sejtembrán és a myelin hüvely megfelelő védelme az oxidatív stressz hatásaival szemben kritikus a megfelelő funkció szempontjából. Az oxidatív stressz mérséklése PARP-gátló kezelés mellett javította a sejtek és magának az állatnak a túlélését is a már említett PAR mag-mitokondrium közti szignalizációja következtében kiváltott AIF transzlokáció mérséklése által. Számos tanulmány igazolta azt, hogy a farmakológiai PARP-gátlás stressz szituációkban az Akt-1 aktiváción keresztül stabibilizálja az OMM-et [225]. Az MKP-1 expresszió fokozásán keresztül pedig annak permeabilizációját is csökkenti, hiszen csökkenti a MAPK család sejthalált előmozdító tagjainak (JNK és p38 MAPK) aktivitását [155].
A mitokondrium egy dinamikus sejtorganellum, mely a mitokondriális minőségkontroll folyamata során a hasadás útján kis egységekké hasad szét, illetve a fúzió során nagy mitokondriumokat, illetve mitokondriális hálózatokat képez [117, 120, 307].
SHR állatok szívizomsejtjeinek mitokondriumaiban jelentős változásokat találtunk a mitokondriumok méretében, egy masszív eltolódás volt ugyanis észlelhető a fragmentált fenotípus irányába (25. és 26. ábra). A fokozott fragmentáció jelensége a nyomásterhelésnek és a következményes krónikus oxidatív stressznek köszönhető és részben természetes védő hatása is van, hiszen a sejt ezáltal szabadul meg a károsodott mitokondriumoktól, melyek fokozott ROS termelés következtében tovább tudnák károsítani a többi mitokondriumot és végső soron a sejtet [307, 312]. Ugyanakkor a károsodott mitokondriumok előtt is többféle út állhat, van ugyanis esély a transzmembrán potenciál és az életképesség helyreállítására és végül a fúzió folymatával újra képes kapcsolódni a retikuláris mitokondrium hálózathoz. Ha azonban a transzmembrán
potenciál összeomlik, az az OPA1 proteolitikus hasításához vezet, mely akadályát képezi az újbóli kapcsolódást a normális mitokondriumok hálózatával. Ekkor ezek a nem életképes organellumok a mitofágia folyamata során eliminálódnak [312-315]. Azon megfigyelésünk, miszerint az OPA1 szint jelentősen csökken a hipertrófiás szívizomzatban (27. ábra) azt mutatja, hogy krónikusan stresszelt (pl. hipertenzív) állatmodellünkben egyértelmű mitokondrium károsodás jelei észlelhetők, mely egybevág más tanulmányok eredményével is, ahol szívelégtelenség/CMP modellekben is csökkent volt a fúziós fehérjék mennyisége [313, 315]. Krónikus PARP-gátló kezelés (L-2286) jelentősen mérsékelte a fragmentáció mértékét, csökkent ugyanis a mitokondrium töredékek száma, megnőtt a mitokondriumok átlagos mérete, és a méretbeli eloszlásuk közelített a normálishoz, a normotenzív állatokban észlelthez. Ugyanakkor a fúziós fehérje, az OPA-1 szintjében csak egy enyhe, nem szignifikáns emelkedés volt látható a kezeletlen SHR-C állatokhoz képest. Így feltehetően egy más mechanizmus felelős azért, hogy a kezelt állatokban (SHR-L) normális méretűek maradtak a mitokondriumok és a belső membrán krisztáinak szerkezete is megőrzött maradt. Például a DRP1 excesszív transzlokációja a mitokondrium felszínére szintén kiválthatja a kriszták remodellingjét Ca2+ dependens módon, egy egyelőre ismeretlen mechanizmus által. A DRP1 transzlokáció fő hatása emellett a fokozott mitokondriális fragmentáció előmozdítása (25.
és 27. ábra).
Könnyen belátható, hogy a mitokondriális minőségkontroll folyamatának (fisszió, fúzió, mitofágia) radikális befolyásolása ugyan akut stressz (IR) során előnyös lehet, krónikus gátlás esetén azonban a károsodott mitokondriumoknak, a károsodott mtDNS-nek a felszaporodásához, ezáltal pedig csökkent ATP és fokozott ROS termelődéshez vezet [313, 316]. Krónikus modellekben a mitokondrium állapotának direkt védelme, a ROS indukálta másodlagos ROS termelődés gátlása és az OMM stabilizálása lehet az az út, amely célravezető és biztonságos lehet. Ezáltal is elérhető a fisszió és a fúzió fiziológiás egyensúlyának a fenntartása [94]. Véleményünk szerint elsősorban ez állhat az L-2286 azon hatásának a hátterében, hogy csökkentette az IFM mitokondriumok fragmentációját.
Ugyanakkor a PARP enzim direkt hatással is lehet a fissziót szabályozó DRP1 aktivitására. A DRP1 GTP-áz aktivitása és mitokondriális transzlokációja, mely SHR állatokban fokozódott, számos poszttranszlációs módosítás hatására változhat. Az AMP-dependens protein kináz/PKA útvonal konstitutív módon foszforilálja a DRP1 GTP-áz effektor doménjében, a szerin 637 pozícióban, mely az enzim funkcióját blokkolja. A
calcineurin azonban ezzel ellentétes hatást fejt ki, defoszforilálja a DRP1-et az S637-on, felszabadítva azt a gátlás alól. Ez is egy lehetséges mechanizmus lehet a hipertrófia során észlelt fokozott fragmentáció hátterében [317, 318].
Emellett a sejt metabolizmus és a mitokondriális morfológia kölcsönösen szabályozza egymást különféle stressz (hypoxia, éhezés, glukóz terhelés) során. A differenciált szívizomsejtek elsősorban zsírsav oxidációval nyerik az energiát, a megtermelt ATP 70-80%-a így képződik, a többi cukor, laktát és keton testek égetésével. Iszkémia során (pl.
a remodelling/szívelégtelenség során a miokardium elégtelen vaszkularizáltsága következtében) a glükóz égetése kerül előtérbe, mivel így magasabb lesz az egységnyi oxigén elfogyasztásával termelt ATP mennyisége [319, 320].
A mitokondriumok metabolikus inflexibilitása is jelentős tényező lehet a remodellálódott szívnek manifeszt szívelégtelenségbe való progressziójában. PARP-1 jelentős aktiválódása során a NAD+ mennyisége, elérhetősége a sejtben jelentősen lecsökken.
Ezáltal stresszelt miokardiumban a sirtuinok funkciója károsodik, mivel ezek működéséhez szintén NAD+ra van szükség [321, 322]. A SIRT1 funkció gátlása a PGC1α-n keresztül a mitokondriális homeosztázisra, így a biogenezis folyamatára, a szubsztrát flexibilitásra és egyéb metabolikus aktivitására így a mitokondriális ROS detoxifikálására is hatással van [323, 324]. Farmakológiai PARP-1 enzim gátlás ezeket a kedvezőtlen változásokat is eliminálhatja a stresszelt szövetekben, mely szintén szerepet játszhat a metabolikus jólét és a struktúrális integritás fenntartásában a kezelt SHR állatokban (SHR-L).