Osztódás morula stádiumig Fénymikroszkópos vizsgálatok

Az emlısöknél a nıi és hím gaméták zigótává való egyesülése nem jelenti a pronucleusok egy sejtes diploiddá való alakulását. A pronuclesok elkülönülten maradnak mindaddig, míg a magmembránjuk feloldódik és az anyai és apai kromoszómák keverednek [168]. Azt feltételezték, hogy ovuláció után a petesejten maradó corona radiata sejtek hamarosan disszociálnak a zona pellucida felületérıl [30].Ma már tudjuk, hogy ez a folyamat sokkal lassaban zajlik le. A zona pellucida alapvetıen szükséges az emlıs embriók normális fejlıdéséhez egészen a teljesen

compaktizálódott késıi morula stádiumig [191]. Nyilvánvaló a zona pellucidának azon funkciója, hogy a blastomereket együtt tartja, de valószínősíthetı az is, hogy szerepe van abban, hogy konzerválja a perivitellináris tér mikrokörnyezetét [46].

A nem szuperovuláltatott és a szuperovuláltatott szarvasmarhánál egyaránt úgy találták, hogy a zigóta két blastomerre való osztódása aránylag gyorsan bekövetkezik, rendszerint 24-28 órával az ovuláció után [132]. In vitro fertilizáció estében azonban az elsı osztódás rendszerint 44 (legkorábban 33) óra múlva következik be [179].

A somatikus sejtekre jellemzı sejtciklus (M, GO, G1, S, G2) más a korai embriók esetében mivel a nucleus citoplazma arány csak mintegy 120 sejtes korban éri el a kifejlett kor értéket [181]. Juhoknál a korai osztódások rövidebbek, különösen a G2

és M fázis az elsı osztódás során [173]. In vivo a második sejtosztódás a 2. napon kezdıdik. A második osztódás kezdetekor egyes blastomerek egy egész sejtciklussal megelızhetik a másikat, így az osztódás aszinkron megy végbe. Azok a sejtek, melyek korábban osztódnak, az inner cell mass (ICM) sejteket adják [44].

Azon kívül, hogy az osztódások kezdete nem esik egybe, a blastomerek nem két egyenlı részre osztódnak, így az egyik leánysejt általában nagyobb, mint a másik [119]. Ez a jelenség az embriófejlıdésben is különbséget hoz létre, az egérnél a nagyobb sejtek rendszerint a „külsı” sejteket, míg a kisebb sejtek a „belsı” sejteket adják [219]. A „külsı belsı” hipotézisnek köszönhetıen a blastomerek két csoportra oszthatók: ICM és trophectoderm (gyakran trophoblast ectodermnek hívják), mely utóbbi, amikor kiegészül az endodermával a trophoblastot alkotja [127].

Az in vivo embrióknál viszonylag nagy a perivitellináris tér, a nyolcsejtes morulák blastomerjei aránylag szabályosak, míg az in vitro fejlıdı zigótában a perivitellináris tér rendkívül kicsi, a 8-sejtes morula blastomerjei nem szabályosak [155].

Közvetlenül is megfigyelhetık, hogy mely sejtekbıl alakulnak ki az ICM sejtek.

Négy és nyolcsejtes embriók elkülönített blastomerjeit hozták össze, un.

háromnyolcad embriókat állítottak elı. Megfigyelték, hogy túlnyomó részben a jobban fejlett és kisebb blastomerekbıl (nyolcsejtes) lettek az ICM sejtek [44].

16 sejtes állapotig az embriókat a sejtek száma alapján csoportosítják, ezután csak morulának nevezik ıket, ezt a fejlettséget fajtól függıen a 3.(pl. juh, sertés), vagy az 5.(pl. szarvasmarha) napon éri el az embrió. Erre az idıpontra a legtöbb embrió az oviductusból az uterusba vándorol. Az egyes blastomerek elvesztik éles kontúrjaikat, az un. compactizáció folyamatán esnek át. Ez nem irreverzibilis átalakulás, mert mindkét irányban lejátszódhat, tehát decompactizálódás és recompactizálódás egyaránt lehetséges. A compactizáció a blastocoel létrejöttének elıfeltétele. Ez a folyadékkal telt üreg általában a 7. napon jelenik meg szarvasmarhánál (juhnál, sertésnél az 5. napon) jelezve compact morula korai blastocystává alakulását [10].

Transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálatok

A koraembriók blastomerjei erıs kontúrokkal vannak körülvéve, kivéve ahol egymáshoz érnek. A két- négysejtes állapotban plazmamembránjuk microvil-lusokkal fedett. Nyolcsejtes állapotban átmeneti fókuszos kapcsolat jön létre a plazmamembránban, amely lencseszerő extracelluláris térrel van elválasztva, tizenhat sejtes állapottól nehéz meghatározni a kapcsolódás fajtáját. A blastomerek összetömörülése, mely a compactizációkor bekövetkezik, Ca függı folyamat, így a sejtek viszonylag könnyen szétválaszthatók in vitro körülmények között Ca mentes közegben [90]. Az elıbbiek mellett az intracelluláris cytosckeletális rendszer is fontos fıleg a mikromanipuláció szempontjából (pl. egy blastomer felszíni károsodás nélkül felszívásához). Ehhez olyan ágensek, mint a cytochalasin B (mely relaxálja a cytosckeletális rendszert) használata elengedhetetlen [173].

A középtest, mely az osztódási barázda maradványa, megtalálható a két blastomer között. Ez azt jelzi, hogy mechanikus kapcsolat állhat fenn a leánysejtek között egy bizonyos ideig, valószínő két sejtciklusig. Centriolumokat nem lehet nyolcsejtes állapot elıtt megfigyelni [68]. Az osztódási folyamatban levı blastomerek citoplazmája úgy jellemezhetı, hogy számos nagy vesiculum található benne, igen nagy zsírszemcsék, primitív „fedett” mitokondriumok, amelyek néhány periferiális lemezt tartalmaznak, és organellum mentes zona helyezkedik el a citoplazma corticalis részében. A mitokondriumok a sima endoplazmatikus retikulummal állnak kapcsolatban. Riboszómák és poliriboszómák a sejt különbözı részein megtalálhatók, míg a Golgi hólyagok és lemezek csak a sejtmag szomszédságában [30]. A sejtmagon belül a magvacskák összetömörödöttek a korai osztódási fázisok idején, de nyolcsejtes állapotban vacuolizálttá válnak és elvesztik compact szerkezetüket a juhnál és szarvasmarhánál 107].

A sertésnél a korai embriók magvacskái szintén összetömörödöttek. Miután a sertés embrió négysejtes állapot után már megkezdi az aktív rRNS (riboszomális RNS) szintézist, a magvacskák szerkezete vagy vakuolizált, vagy esetleg átmeneti, azaz vakuolizált és compact változat egy magvacskán belül észlelhetı [156]. A compactizáció folyamatát ultrastrukturális változások kísérik. A blasomerek és a citoplazmán belüli alkotórészek elvesztik gömbalakjukat. Amint a mitokondriumok elvesztik „fedett” megjelenésüket, keresztlemezek kezdenek kialakulni. A compactizálódó morula külsı sejtjei polarizálódni kezdenek, mely folyamat odáig vezet, hogy jól látható különbség figyelhetı meg minden sejt külsı és belsı fele között. A szarvasmarha embrióban ezeknek a polarizált sejteknek az oldalsó plazmamembránján nincsenek mikrovillusok, viszont apikálisan szoros kapcsolódás van, amely valószínő részt vesz a blastocoel üregének és belsı miliıjének kialakításában. A szoros kapcsolódás miatt a compact morula sejtjeit rendkívül nehéz mechanikailag szétválasztani [30].

Fiziológia

A korai embrió osztódásai során a különbözı funkciók irányítása átkerül az anyai genomból az embrionális genomba. Szarvasmarhában és juhban ez a folyamat valószínő a nyolcsejtes embrió tizenhat sejtes embrióvá osztódása közben zajlik le.

Ezt a tényt a nucleolusok citológiai és ultrastrukturális vizsgálatával állapították meg [107]. A nyolcsejtes embriók rRNS és hnRNS vizsgálatával szintén igazolták [153].

Kecskénél és egérnél úgy találták, hogy mindez kb. a kétsejtes, sertésnél négysejtes állapot körül zajlik le. Egérben a négy és nyolcsejtes állapotban az anyai mRNS már nem íródik át [103]. Túlságosan leegyszerősített lenne azonban az embrionális fejlıdést szabályozását úgy tekinteni, hogy mielıtt az embrionális genom aktiválódik, azt megelızıen teljesen anyai szabályozás alatt áll. Pronucleus állapotban levı egér zigóták manipulációs kísérleteivel igazolták, hogy a spermiumból származó kromoszómáknak, nemcsak annyi feladata van, hogy velük együtt kialakuljon a zigóta diploid szerkezete, hanem a hímre jellemzı „imprinting”

(amely a spermatogenezis alatt kialakul) közvetítése is. Úgy tőnik ez alapvetı eleme a normális embriófejlıdésnek [187]. A kromoszómák a szülıi eredetre „emlékeznek”

az egyedfejlıdés során és kifejlett korban is [131].

Csak a korai osztódási periódus alatt aktív mindkét X kromoszóma a nıivarú embriónál, ezután egyik inaktiválódik. Ez a folyamat az elsı két hét alatt lejátszódik a szarvasmarhánál és közel hasonló idı alatt a lónál is [171]. A második X kromoszóma inaktiválódása elıtt, tehát a nıivarú embriókban kétszer annyi aktív X kromoszóma gén van, mint a hímben, melymetabolitikus tesztekkel mérhetı és az embrió ivara megállapítható [206]. Ma általánosan alkalmazott az Y kromoszóma meghatározása PCR-rel.

Egérbıl izoláltak olyan gént, mely az implantálódás elıtti embrió fejlıdését meghatározza ez a Ped gén (Preimplantation embryo development) [200]. Ide tartozik még egy érdekes megfigyelés, hogy az osztódás gyorsabb a hímivarú, mint a nıivarú egérben [192].

Az is fontos kérdés, hogy az anyai vagy az embrionális genom irányítja-e az embrió anyagcseréjét már az egyedfejlıdés kezdetén is. Minden sejtosztódáshoz szükséges a megkívánt anyagcseretermékek és energiaforrások biztosítása, tehát az embrió „tud a saját megtermékenyülésérıl”. Ez az un. Early Pregnancy Factor (EPF) azaz a korai vemhességi faktor, melynek ismerete lehetıséget biztosítana a haszonállatok korai vemhességi diagnosztikájában [141]. Izoláltak egy foszfogliceridet PAF (Platelet Activating Factor), amelyet a koraembriók termelnek. A PAF elengedhetetlenül szükséges egérben a vemhesség kifejlıdéséhez és az EPF expresszióját indukálja [144].

Igazolták, hogy a foszfolipid szintézis az elsı osztódás után minimális, ekkor a membránfelületek és sejtorganellumok száma nem nı jelentıs mértékben. A foszfolipid szintézis a következı sejtosztódások és a compactizáció folyamán azonban a 9-13-szorosára emelkedik. Ezalatt a plazmamembrán felületek megkettızıdnek és minden sejtben a sejt organellumok száma lényegesen emelkedik [157].

2. Blastocysta stádium, hatching, beágyazódás elıtti elongáció