Nyers tehéntejekből izolált Staphylococcus aureus törzsek

2005 júniusától 2006 augusztusáig tartó vizsgálatainkba Hajdú-Bihar megyei tejtermelő gazdaságokat vontunk be az alábbiak szerint: hét nagygazdaság (>

1.000.000 l/év tejtermelés), négy közepes méretű gazdaság (100.000-1.000.000 l/év) és kilenc kisgazdaság (< 100.000 l/év). A tejelő tehenek száma gazdaságonként 4 és 520 közötti volt. A nagy és közepes méretű gazdaságokban jellemzően holstein-fríz, míg a kisgazdaságokban többnyire magyar tarka fajtájú tehenek termeltek. Az egyes gazdaságok különféle tartás- és fejésmódokat alkalmaztak (3.2. táblázat). Az elegytej Staph. aureus élősejt-számát mindegyik gazdaságban négy-négy alkalommal határoztuk meg a vizsgálatok során. A molekuláris biológiai módszerekkel (PCR és PFGE) megvizsgált izolátumokat a 2006. januári mintavételek alkalmával gyűjtöttük.

3.2. táblázat: A vizsgált gazdaságok főbb jellemzői

Méret Éves tejtermelés (t)

Vizsgált gazdaságok száma

Tartásmód Fejésmód

Nagy > 1000 7 Mélyalmos (3) és

pihenőboxos (4)

Fejőházi (7)

Közepes 100-1000 4 Mélyalmos (1) és

kötött (3)

Fejőházi (1), sajtáros (1) és tejvezetékes (2)

Kicsi < 100 9 Kötött (9) Sajtáros (9)

3.3.2. Staphylococcus aureus izolálása és élősejt-számainak meghatározása

Az összes gazdaságban, minden egyes mintavételezés során 50 ml-nyi nyers tej mintákat gyűjtöttünk, amelyeket ezt követően 4°C-on tartottunk a laboratóriumi

vizsgálatok kezdetéig. A Staph. aureus elegytejből történő izolálását a Nemzetközi Szabványügyi Szervezet EN ISO 6888-1 jelű szabványmódszerében leírtak szerint végeztük (ISO, 1999), tojássárga–tellurit emulzióval kiegészített Baird-Parker táptalaj (Oxoid, Basingstoke, Egyesült Királyság) felhasználásával. Az agarlemezeket aerob körülmények között inkubáltuk 37°C-on, 24-48 órán keresztül. Amennyiben lehetséges volt, levettünk a lemezekről 5-5 db tipikus, ill. atipikus telepet, és elvégeztük ezek további azonosítását.

Azokban a gazdaságokban, ahol problémaként jelentkezett a nagy Staph.

aureus-sejtszám, a fejés megkezdése előtt néhány felületről (pl. fejőkehely, tejgyűjtő tartály, fejősajtár, tejszállító kanna, tejház belső falfelülete, fejő tenyere, stb.) környezeti mintákat is vettünk steril tamponok segítségével. A környezeti minták vizsgálata az elegytej mintákéval megegyezően történt.

Emellett bizonyos esetekben gyűjtöttünk még tejmintákat tőgygyulladásban szenvedő tehenek beteg tőgynegyedeiből is. Ezeket Columbia véresagarra (Oxoid) szélesztettük ki és a lemezeket 37°C-on, 24 órán keresztül, aerob körülmények között inkubáltuk. Mindegyik lemez felületéről véletlenszerűen levettünk néhány gyanús telepet és elvégeztük fenotípusos azonosításukat.

Az agarlemezekről levett Staph. aureus-gyanús telepeket aerob körülmények között, 37°C-on, 18-24 órán keresztül agy–szív táplevesben (Brain Heart Infusion Broth; Oxoid) inkubálva felszaporítottuk, majd kiszélesztettük a másik fajta szelektív agarlemez felületére, azaz Columbia véresagarra (elegytej-, ill. környezeti eredetű minták), vagy tojássárga–tellurit emulzióval kiegészített Baird-Parker táptalajra (tőgynegyed-tej minták) is. Az izolátumokat csak akkor tekintettük Staph. aureus-nak, ha az alábbi vizsgálatok eredményei ezt egyöntetűen megerősítették:

telepmorfológia, Gram-festés, kataláz teszt, tellurit redukció, lecitináz aktivitás, hemolitikus tulajdonságok, koaguláz termelés: szabad koaguláz (csőpróba), ill.

sajtfalhoz kötött koaguláz (“clumping factor”) (Staphylase test; Oxoid).

A különböző üzemméretű gazdaságokból gyűjtött nyers elegytej minták Staph.

aureus élősejt-számainak csoportátlagait összehasonlítottuk, hogy meghatározzuk a köztük lévő eltérések szignifikáns voltát. A cfu/ml-ben kifejezett sejtszámokat logaritmizáltuk és az adatokat a STATISTICA 7.1 szoftvercsomag (StatSoft) t-próbájának segítségével vizsgáltuk, 95%-os szignifikancia szinten. Eredményeinket az EU tejhigiéniai rendeletében (Council of the European Communities, 1992) szereplő, vonatkozó határértékekkel is összehasonlítottuk.

3.3.3. Staphylococcus aureus törzsek antibiotikum-érzékenységének vizsgálata A Staph. aureus izolátumok antibiotikum-érzékenységének vizsgálatát Mueller-Hinton agaron (Oxoid), agardiffúziós korongteszt módszerrel végeztük el, a Clinical Laboratory Standards Institute előírásai szerint (CLSI, 2006). Az alábbi antibiotikumokat teszteltük: penicillin (10 U/korong), methicillin (5 µg/korong), cefoxitin (30 µg/korong), lincomycin (15 µg/korong), tetracycline (30 µg/korong), erythromycin (15 µg/korong) és sulfamethoxazole / trimethoprim (23,75 / 1,25 µg/korong). A kontroll törzs szerepét a Staph. aureus ATCC 25923 töltötte be.

3.3.4. A Staphylococcus enterotoxinokat kódoló gének amplifikációja

A kilenc kiválasztott SE-gén (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei és sej), valamint a TSST-1 gén (tst) jelenlétének detektálásához használt oligonukleotid primerek bázissorrendjét és a PCR termékek méretét a 3.3. táblázat szemlélteti. A

DNS amplifikáció 30 ciklusban történt (95°C-on 60 mp-ig, 55°C-on 60 mp-ig és 72°C-on 60 mp-ig), az utolsó ciklus után egy 72°C-os 10 perces végső szakasz következett. Az amplifikációhoz automata, programozható, GeneAmp PCR System 9700 típusú készüléket (Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA) és Platinum Taq DNS-polimerázt (Invitrogen, Lofer, Ausztria) használtunk. A PCR termékeket 1,5%-os agaróz gélen történő elektroforézist követően etidium-bromiddal megfestettük és UV-megvilágításban lefényképeztük.

3.3. táblázat: Staphylococcus enterotoxinokat kódoló gének amplifikációjához használt oligonukleotid primerek bázissorrendje és a PCR termékek mérete

Gén Primer Primer szekvencia (5′–3′) PCR termék

mérete (bp)

3.3.5. Staphylococcus aureus törzsek genetikai kapcsolatainak felderítése

A Staph. aureus izolátumok kromoszomális DNS-ének makrorestrikciós analíziséhez SmaI restrikciós enzimet (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) és PFGE-t alkalmaztunk. A vizsgálatokhoz a Staph. aureus izolátumok agy–szív táplevesben, aerob körülmények között, 37°C-on, 18-24 órán keresztül inkubált tisztatenyészeteit használtuk. A sejteket centrifugálás után PIV oldatban (1 M NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0) újraszuszpendáltuk. A szuszpenziót egyenlő mennyiségű, 1,2% alacsony olvadáspontú SeaKem Gold agarózzal (Cambrex Bio Science, Rockland, ME, USA) elegyítettük. A megszilárdult agardugókat 10 mg/ml ribonukleázzal (RNáz), 10 mg/ml lizozimmal és 5 mg/ml lizosztafinnal kiegészített EC lízis pufferben (6 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 0,1 M EDTA, 0,2% Na-dezoxikolát, 0,5%

Na-lauril-szarkozin) inkubáltuk 37°C-on, egy éjszakán át. Ezután az EC lízis puffert eltávolítottuk, majd a dugókat egy éjszakára ESP pufferbe (0,5 M EDTA, 1% lauril-szarkozin, 1 mg/ml proteináz K) helyeztük és 50°C-on tartottuk. A következő napon a dugókat TE pufferben (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) 54°C-on, 30-60 percen keresztül négy alkalommal átmostuk. Az így elkészített dugókat a felhasználásig TE pufferben tároltuk 4°C-on.

A dugókat, a gyártó előírásai szerint, 40 U SmaI (New England BioLabs) enzimmel emésztettük. Az emésztett DNS fragmentumok szétválasztása 1%

SeaKem Gold agaróz gélben (Cambrex Bio Science) történt, CHEF DR III (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) PFGE készülék és 0,5 × Tris-borát-EDTA puffer (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 1 M bórsav) használatával. A futtatási paraméterek az alábbiak

szerint alakultak: 5-15 mp 7 órán keresztül (I. blokk), majd 15-60 mp 19 órán keresztül (II. blokk); 6 V/cm; 120°-os szög; 14°C-on. A futtatott géleket etidium-bromiddal (0,5 µg/ml) 30 percig festettük, majd desztillált vízzel 30-60 percig tartó mosással eltávolítottuk a felesleges festéket. A fragmentumokat UV-fénnyel láthatóvá tettük és lefényképeztük. Markerként XbaI enzimmel emésztett Salmonella enterica subsp. enterica serotype Braenderup H9812 törzs szolgált.

A DNS restrikciós sávok elemzését Molecular Analyst Fingerprinting II, version 3.0 (Bio-Rad) szoftver segítségével végeztük el. A hasonlóságok leírására a Dice koefficienst, a csoportanalízisre (dendrogram készítésére) pedig a számtani átlagok súlyozatlan pár-csoport módszerét (UPGMA) alkalmaztuk. Az optimalizáció értéke 0,5%, a pozíciótűrés 1,0% volt. A klaszterek kialakítása 86%-os hasonlósági szint felett történt. Az izolátumokat 100%-os hasonlósági szint esetén genetikailag azonosaknak (főtípus, pulzotípus), 86-99%-os hasonlóság esetén közeli rokonoknak (altípus), 86% alatt pedig különböző pulzotípusoknak tekintettük. A főtípusokat nagybetűvel, az altípusokat nagybetűvel és arab számmal jelöltük.

3.4. Escherichia coli O157:H7 tejből történő kimutatására szolgáló módszerek