NOTCH3 gén mutációhoz társuló neuropathia

29 Perifériás neuropathia egyes genetikailag determinált betegségekben szekunderen is kialakulhat. Erre irányultak vizsgálataink a CADASIL (cerebralis autoszomalis domináns arteriopathia subcorticalis infarktusokkal és leukoencephalopathiával) szindrómában. A CADASIL rekurráló cerebralis ischaemiás epizódokkal, demenciával, pseudobulbaris paresissel, migrainnel és pszichiátriai tünetegyüttessel jellemezhető kórkép (Dichgans et al. 2002). A betegségért a NOTCH3 gén mutációja a felelős (Joutel et al. 1997). A NOTCH3 pontos szerepe pontosan még nem ismert. Feltételezzük, hogy az embryonalis korban bizonyos apoptotikus feladatokban játszik szerepet. A betegségre jellegzetes a bőr, az izom és a perifériás idegek kis véredényeinek simaizom sejtjei környezetében levő granularis osmiophil anyag (GOM) jelenléte (Goebel et al. 1997). Irodalmi adatok arra utalnak, hogy a CADASIL-ban mitochondrialis rendellenességek is lehetnek (de la Pena et al. 2001, Finnila et al. 2001, Malandrini et al. 2002).

Vizsgálatainkkal arra szerettünk volna választ kapni, hogy CADASIL-ban milyen strukturális változások alakulnak ki a n. suralisban és az izomban, és hogy ezek az elváltozások közvetlenül a NOTCH3 gén mutációja eredményeként keletkeznek vagy esetleg a mitochondrialis genom rendellenessége okozza azokat.

3. BETEGANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

A vizsgálatok vagy a rutin diagnosztika részét képezték, vagy hatályos etikai bizottsági engedély állt rendelkezésünkre. Az alábbiakban a vizsgált beteganyagot és az alkalmazott vizsgáló módszereket foglaljuk röviden össze.

3.1 Vizsgált betegek

Valamennyi esetben részletes családi anamnézist vettünk föl, családfát készítettünk, a szokásos részletes neurológiai, egyes esetekben pszichiátriai vizsgálatok mellett laboratóriumi, neuroradiológiai, Doppler, elektrofiziológiai, morfológiai és genetikai vizsgálatok történtek. A vizsgálatok elvégzésébe és azok eredményeinek tudományos célú felhasználására a betegek beleegyező nyilatkozatot töltöttek ki. A cerebralis reserv kapacitást 15 mitochondrialis betegben mértük (életkor: 24-66 év, átlag életkor: 43.3 év) és 18 egészséges kontroll személyben (életkor: 20-61 év, átlag életkor: 38.47 év. A fenti mitochondrialis kohortból 5 betegnél készült PET vizsgálat. Az mtDNS tRNS^Lys mutációkat elemző vizsgálatainkban 334 (210 nő és 124 férfi) beteg és 150

kontroll személy DNS mintáját elemeztük. A betegek átlagéletkora 39,4 év volt (nők: 40,2 év, ffi: 32,5 év). A mitochondrialis tRNS^Leu(UUR)

Az FDG (2-(18F)-fluoro-deoxy-D-glucose) felvételt PET segítségével 5 betegben (3 férfi 2 nő), átlagéletkor 35+7 év vizsgáltuk. A PET méréseket GE 4096 Plus teljes test positron camera segítségével végeztük. Az FDG tracert 30 perccel a genetikai epidemiológiai vizsgálatok során 3243G szubsztitúcióját 631 (361 nő és 270 férfi) betegen vizsgáltuk. A betegek átlagéletkora 36,3 év volt (nők: 38,1 év, ffi:34,4 év). A mintagyűjtést 1999. január és 2007. december között végeztük. A vizsgálatba Baranya, Borsod-Abaúj-Zemplén, Hajdú-Bihar, Szabolcs-Szatmár-Bereg megye valamint Budapest ismeretlen etiológiájú ischaemiás stroke, ataxia, maternalisan öröklődő sensorineuralis hallásvesztés, myopathia, vagy hypotonia miatt genetikai vizsgálatra küldött betegeket vontuk be, akiknél a multiszisztémás tünetegyüttes, a családi anamnézis és egyes laboratóriumi értékek felvetették a mitochondrialis betegség lehetőségét. Az A8344G mutáció elfordulási gyakoriságának vizsgálata során 513 beteget (302 nő és 211 férfi) vizsgáltunk. A kohortba Borsod -Abaúj-Zemplén, Hajdú-Bihar, Szabolcs-Szatmár-Bereg megye valamint Pest megye és Budapest feltételezetten mitochondrialis betegségben szenvedő betegeket vontuk be. A betegek átlagéletkora 39 év volt. Mind a betegek, mind az egészséges kontroll személyek a vizsgálat előtt részletes felvilágosítás kaptak, amely alapján a genetikai vizsgálatba, a minták további kutatási célú megőrzésébe és az eredmények szakirodalmi publikálásba beleegyeztek. A minták tárolása az Európai Uniós követelményeknek megfelelően az Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézet Molekuláris Neurológiai Osztály, majd későbbiekben a Semmelweis Egyetem Neurológiai Klinika, Molekuláris Neurológiai Központ neurológiai és pszichiátriai biobankjában történt, amely a NEPSYBANK részét képezi (23. Közlemény). A vizsgálatokhoz az intézeti etikai bizottságok bocsájtottak ki engedélyt.

A Fázis I sonoporációs vizsgálatok során 5 egészséges férfi önkéntest vizsgáltunk.

Az önkéntesek írásban nyilatkoztak, hogy semmilyen betegségben nem szenvedtek, gyógyszert nem szedtek és önként vállalták a vizsgálatban való részvételt. A vizsgálatot az ETT-TUKEB engedélyezte.

3.2. Alkalmazott módszerek 3.2.1 PET és Doppler vizsgálat

31 mérés előtt ív. adtuk be, dózisa: 4.35+2.33 mCi, vagy 59+27 (Ci/tskg) volt. A PET felvételeket Hanning filterrel rekonstruáltuk, az eredményeket kontroll csoporthoz hasonlítottuk. A betegek eredményeit egy 4 nőből és 1 férfiból álló kontroll csoport eredményeihez hasonlítottuk. Átlagéletkoruk 33+9 év, beadott FDG dózis 4.35+2.33 mCi vagy 59+27Ci/tskg volt. A kontroll egyének nemzetközi etikai elvárásoknak megfelelő (a Helsinki Deklarációt elveinek is megfelelő) vizsgálatát. a Debreceni Orvostudományi Egyetem etikai bizottsága engedélyezte. A PET vizsgálatok sensoros deprivatióban készültek, az adatgyűjtés 30 percig tartott. Minden PET képet a komputerizált Human Brain Atlas (HBA) rendszerbe továbbítottunk. (Roland et al. 1994). Első lépésben az individuális PET felvételeket mind méret, mind alak szerint illesztettük a standard HBA agy konturhoz (stereotaxiás standardizálás) l A mitochondrialis betegek állapota miatt szándékosan hagytuk el az arteriás vérvétellel járó kvantitatív PET méréseket, helyette az agyi radioaktivitási adatokat normalizáció technikával pszeudokvantifikáltuk. Az egyes sugárzási arányt felvételenként normalizáltuk a Roland által leírt módszer szerint (1993). A cerebralis CMRglu metabolizmus arányát (mol/100g/min) az egyes központi idegrendszeri régiókban a kontroll csoport átlag sphericus volumen-of interest-jéhez (VOI) hasonlítottuk 10 mm-es átmérőben. Az anatómiai régiók azonosítása a HBA standard agy és adatbázis alapján történt. A cerebrovascularis reserve kapacitást (CRC) transcranialis Dopplerrel (TCD) vizsgáltuk 15 mitochondrialis betegségben szenvedő betegben és 18 egészséges kontrollban. A betegeket 3 csoportba osztottuk (1) interictalis mitochondrialis encephalomyopathia, lactacidosis és stroke-szerű epizódok (MELAS), (2) chronikus progressziv ophthalmoplegia externás betegek (CPEO), és (3) mitochondrialis myopathiás, neuropathiás betegek (MM). A diagnózis a klinikai fenotípuson, hisztokémiai és molekuláris genetikai vizsgálatokon alapult. Az a. cerebri mediák cerebralis vérátáramlási sebességét (CBV) TCD-vel mértük 1 g intravénás acetazolamide adása előtt és után. Az MCAV-t, a pulsatilitási indexet (PI) 45, 50, 55 mm mélységben mértük nyugalomban és 20 perccel az acetazolamide adását követően 5 perces intervallumokban. Minden csoportban mindkét a. cerebri mediában az átlagos sebességet értékeltük. Mindhárom csoport MCAV értékeit egymáshoz, illetve az egészséges kontrollhoz hasonlítottuk. A variancia analízist az egyes csoportok közötti különbség megállapítására használtuk (p<0.05). A

cerebrovascularis reaktivitást (CR) és cerebrovascularis reserve kapacitást (CRC) a következők szerint kalkuláltuk: CR=100(vt-v0)/v0; CRC= 100(vmax -v0)/v0, ahol v0 = v sebesség acetazolamide adminisztráció előtt, vt = sebesség acetazolamide adminisztráció után, vmax = maximalis sebesség acetazolamide injekció után.

3.2.2. Morfológiai vizsgálatok: fény- és elektronmikroszkópos vizsgálatok Az izom- és ideg biopszia értékelésekor a rutin standard hisztológiai, hisztokémiai, immunhisztokémiai fény- és elektronmikroszkópos metodikákat alkalmaztuk. Az izomdystrophiák immunhisztokémiai/Western blot vizsgálataihoz a következő monoclonalis antitesteket (Novocastra) használtuk:

dystrophin (NCL-DYS1,2,3), α-, β-, γ-, δ -sarcoglycan (NCL-SARC) hyperglycosylált α -DG (VIA4-1), merosin, laminin, dysferlin, collagen VI, dysferlin (NLC-Hamlet) caveolin-3, calpain (NCL-CALP-2C4) a gyártók által javasolt kondíciók szerint. Néhány szelektált LGMD esetben a növényi lektinek, mint a búzacsíra agglutinin (WGA 1:100), és mogyoró agglutinin (PNA 1:100) jelenlétét is vizsgáltuk immunhisztokémiai módszerrel. A primer ellenanyaggal történő inkubálás után egér-ellenes biotinnal (DAKO) és streptavidinnel (DAKO) kezeltük a mintákat, majd azt diaminobenzidin (DAB) segítségével vizualizáltuk.

A lektin kötést tormaperoxidáz streptavidin-DAB reakcióval vizualizáltuk. A Western-blot során az izomprotein-homogenizátumot 8%-os polyacrylamid gélen szeparáltuk, majd PVDF membránra (BioRad) blottoltuk, és az elsődleges ellenanyagokkal inkubáltuk. Szekunder antitestként anti egér biotint (DAKO) és streptavidint (DAKO) használtunk. A blot detektálása ECL Plus kittel (Amersham) történt a cég által javasolt feltételek mellett.

N. suralis morfometria

A neuropathia súlyosságát komputerizált morfometriás program segítségével állapítottuk meg (Video Image Processing Evaluation and Recording System - VIPER, Gesotec Darmstadt, Németország). A myelin felület/endoneuralis felület százalékos arányát, a myelinizált rostok mm²

Elektronmikroszkópos vizsgálatok és morfometria

-kénti számát, az axonok felületének és a teljes idegrost felületének arányát határoztuk meg.

33 Az ultravékony metszeteket uranyl acetáttal és ólomcitráttal kontrasztoztuk és Philips T 400 elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. A n. suralis és az izomszövet kis véredényeinek endothel sejtjeiben, pericytáiban és simaizom sejtjeiben számoltuk a mitochondriumok számát, 20-20 mitochondrialis betegben és 4-2 kontroll esetben. Két egymástól független vizsgáló végezte a számolást. A mitochondriumok keresztmetszetének felületét és az azt tartalmazó sejt felületét mértük, valamint azok arányát számítottuk szemiautomatikus komputerizált morfometriás rendszerrel. A statisztikai analízis a Wilcoxon teszttel történt.

3.2.3. Molekuláris biológiai metodikák

Mitochondrialis betegségek vizsgálata során alkalmazott módszerek DNS izolálás

A DNS-t vérből, ill. 50 beteg esetében vázizomból, izoláltuk Qiagen Blood (Qiagen) valamint Qiagen Tissue Kit segítségével a gyártó által megadott instrukciók szerint. A DNS koncentrációt UV spektrofotométer segítségével 260 nm abszorbanciánál mértük. A tisztasági fokot a 260 nm-es és a 280 nm-es abszorbancia értékek hányadosával határoztuk meg.

PCR-RFLP vizsgálat

Az mtDNS leggyakoribb mutációit PCR-RFLP módszerrel vizsgáltuk. Az mtDNS patogén mutációs hot spot régióit, az nt 3160-3296, nt 8155-8367, nt 8345-10011, nt 8105-8536 PCR segítségével amplifikáltuk. A reakcióhoz a primereket 300 nmol/L végkoncentrációban használtuk, 100 nmol/L MgCl2-ot, és 1 unit Taq polimerázt (Immolase, Bioline GmbH, Németország) hozzáadva, a reakcióelegyet RNáz-mentesített desztillált vízzel (RT-PCR grade water, AMBION) 50 µl végtérfogatra egészítettük ki. A primerek szekvenciái honlapon olvashatók. A PCR reakciók során a következő programot használtuk:

kezdeti denaturáció 94°C-on 5 perc, 35 ciklus (denaturáció 94°C 30 másodperc, anelláció 50-60°C 30 másodperc, szintézis 72°C 30 másodperc), majd a végső szintézis 72°C-on 7 perc. Az A3243G, A8344G, T8356C, T8993C, T8993G szubsztitúciók kimutatására a kapott PCR terméket 37°C-on restrikciós endonukleázokkal (HaeIII, BanII, HpaII, AvaI) emésztettük. A restrikciós mintázatot 2%-os agaróz vagy 12%-os polyacrylamid gélen analizáltuk. A géleket

etídium-bromiddal festettük, majd a kapott band-ek nagyságát a hasítatlan mintához viszonyítva Quantity One Software (BIO-RAD) segítségével határoztuk meg.

DNS bidirekcionális szekvenálás

Az mtDNS tRNS-eit és azokat a protein kódoló géneket, ahol az irodalomban gyakran találtak patogén mutációkat PCR-rel amplifikáltuk. A primerek szekvenciái a www.molneur.eoldal.hu honlapon olvashatók. A PCR terméket Sure Clean Plus kit (BIOLINE) segítségével tisztítottuk. A tisztított PCR termékhez 1 unit 3.1. Big Dye Terminator enzimet adtunk (Big Dye Terminator v 3.1 cycle sequencing RR-24, Applied Biosystems), valamint ugyanennyi térfogat Big Dye puffert, amely a fluoreszcensen jelölt didoexinukleotidokat is tartalmazta. A szekvenáló reakciót az illető régióra specifikus reverz primerekkel végeztük el. A szekvenáló PCR elvégzése után a termékeket NucleoSeq kit (BIOLINE) segítségével tisztítottuk. A kérdéses régiót ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer szekvenátorral vizsgáltuk. A kapott szekvenciákat is az NCBI Blast program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) segítségével a humán mitochondrialis referencia genom nukleotid és aminosav sorrendjével hasonlítottuk össze. A nukleáris genom RRM2B gén szekvenálás primereinek szekvenciái is a www.molneur.eoldal.hu honlapon olvashatók.

Fibroblast tenyésztés: A bőrbioptatum fibroblasztjait izolálást követően Dulbecco által módosított Eagle mediumban (DMEM) tenyésztettük (GIBCO, Invitrogene GmbH, Austria) 20% foetalis marha serum (GIBCO), 0.5% penicillin-streptomycin (GIBCO), és 0.3% Fungisone (GIBCO) jelenlétében 37 ^oC –on 5%

CO2 95% levegőt tartalmazó légtérben.

Légzési lánc komplex aktivitás meghatározás: A mitochondrialis komplex I aktivitást Enzyme Activity Microplate Assay Kit (MitoScience, Eugene, Oregon, USA) segítségével mértük a gyártó által megadott instrukciók szerint. A Komplex I aktivitás mérés alapját a NADH-nak a NAD+-á oxidációja és a jelölő anyag szimultán redukciója képezte. A jelölő anyag redukcióját a 450 nm-en észlelt fokozott adszorbancia jelezte.

35 Linkage analízis

A linkage analízis genom-wide scannel készült a 6,090 SNP-t tartalmazó Illumina Infinium HumanLinkage-12 panel (Illumina Inc, San Diego, CA) alapján. A MERLIN program segítségével végzett multipoint LOD score analízisbe 9 beteg és 3 egészséges családtagjainak mintája került be. Az analízis során autoszomalis domináns öröklődésmenetet, teljes penetranciát és a fenokópiák hiányát tételeztük föl. A betegség allél frekvenciáját 0.001-nek adtuk meg. Valamennyi marker allél frekvenciáját azonosnak becsültük.

A heteroplasmikus nőstény egerek genotípizálása

A heteroplasmikus egerek Dr. Eric Shoubridge laboratóriumából származtak és Jenuth et al. (1996) metodikája alapján keletkeztek. Az egerek az NZBés BALB egerek mtDNS-it tartalmazták. A 2 genotípus 101 nukleotidban különbözik egymástól. A genotípizálás RFLP metodikával történt, az RsaI hasítási helye a 3691nt-nél az ND1 génben csak a BALB típusban van jelen, az NZB egérben hiányzik. Az egyes egerek heteroplasmia arányát a farokbiopszia mintából határoztuk meg. A teljes DNS-t a következő primerekkel amplifikáltuk: forward primer MT9 nt3571–3591, 5'-AGCATCTTATCCACGCTTCC-3'; reverse primer MT10 nt4079–4059, 5'-CTGCTTCAGTTGATCGTGGGT-3'. A PCR összeállításnál és a ciklus kondíciók beállításánál Jenuth et al (1996) módszerét követtük. Röviden: a PCR reakció volumene 50 µl volt, mely 1x kalium mentes PCR puffert (100 mmol/l Tris–HCl, pH 8.3), 2.5 mmol/l MgCl_2- t, valamennyi dNTP-ből 200 µmol/l-t, az MT9 and MT10 primerek 0.4 µmol/l-tés 1.25 IU Taq polymeraset (Gibco, Canada) tartalmazott. A PCR- Perkin Elmer 9600 thermocycleren futott a következő módon: 5 min denaturáció - 94°C, majd 30 ciklusban 30 - 94°C, 30 s - 55°Cés 30 s 72°C. Az utolsó ciklusban 1.5 µCi of [

-32P]dCTP–t adtunk a PCR termékhez radioktív jelölés céljából. A reakció elegy 15µl-ét emésztettük 10 U RsaI-val 37°C-on egy éjszakán át és azt követően 10%

nem-denaturáló polyacrylamidgélen futtattuk.

A heteroplasmikus egér oocyták és az embryok izolálása Hat hetes – 4 hónapos egerek ovulációs metafázis II oocytáit izoláltuk. A munkát a McGill University „Animal Care Committee”-je engedélyezte. Ismert heteroplasmia arányú nőstényeket intraperitonealisan 7.5IU terhes kanca szérum

gonadotropinnal (Sigma, Canada) szuperovuláltuk, majd 5 IU hCG-t (Sigma) adtunk 44–48 órával később. Az oviductusokat 16-18 óra múlva eltávolítottuk és az oocytákat az oviductus duzzadt ampullájából HEPES-pufferrel és káliummal optimalizált médiumba (H-KSOM) juttattuk ki. Az oocyták körül levő cumulust rövid Hyaluronidase (300 µg/ml) inkubációval tüntettük el. Korai stádiumú embryok nyeréséhez a superovulált egereket CB1 egerekkel pároztattuk egy éjjelen át. A 2-, 4- és 8-sejtes embryokat a terhes egerek oviductusának átfújásával a megtermékenyítést követő 1.5, –2 és –2.5. napon nyertük. Az embryokat 1 vagy 2 napon át in vitro tenyésztettük mielőtt szétválasztottuk a blastomereket. A tenyésztés re-equilibrált friss KSOM mediumban történt paraffin olaj alatt 37°C-on 5% CO2-ban.

Blastomer kollekció

Az oocyták és az embryok zona pellucidáját savas Tyrode oldattal (pH 2.5) történő inkubációval oldottuk, majd H-KSOM-ben mostuk azokat. Minden oocyta első poláris testjét óvatosan aspiráltuk és 5 µl of alkalikus lysis puffert tartalmazó PCR csőbe transzferáltuk. Az ooplasma egy szeparált csőbe került. A zona mentesembryokat 5 percig Ca²⁺-and Mg²⁺-mentes mediumban inkubáltuk, majd a szeparált blastomereket lysis puffert tartalmazó PCR csőbe helyeztük. A blastomer lysis 15 percig 65°C- ra melegítéssel történt, melyet követően 5 µl neutralizáló puffert adtunk a DNS-t tartalmazó oldathoz.

Az oocyták, poláris testek és blastomerek mtDNS genotípusának meghatározása Az egyes sejttípusokból más és más mennyiségű lysatumot használtunk a PCR reakcióhoz. Az oocytákhoz 1 µl, a poláris testekhez 3 µl, a szeparált blastomerekhez 2 µl-t lysis puffert adtunk. Minden kísérletben volt negatív kontroll, amely 5 µl

A blastomerek, oocyták, poláris testek radioaktív géljeinek értékelése A szárított géleket Storm PhosphorImagerrel (Molecular Dynamics) értékeltük.

bideszt. vizet jelentett. Minden mérés duplikátumban történt.

A mérés során az egerek genotípusának meghatározásánál leirt módszert követtük.

Az RFLP és a gélelektroforézis a ”Heteroplasmikus nőstény egerek genotípizálása” fejezetben leírtak szerint történt.

Az NZB mtDNS százalékos arányát az RFLP hasítási mintázatból kalkuláltuk. Az

37 mtDNS NZB heteroplasmia %-os arányát minden sejtre kiszámítottuk, a duplikátumhoz hasonlítottuk és ezt követően variációs koefficienst számítottunk (CV). Ha a duplikátum CV-je <10 volt, az eredményt elfogadtuk, ha a CV-je >10 volt, triplikátum is készült. Ha a triplikatum CVje is >10 volt, a mintát kizártuk az elemzésből.

PMP22 gén duplikáció/deléció meghatározás

A PMP22 gén duplikácóját Real-Time PCR módszerrel határoztuk meg (ABI 7300) standard metodika szerint (Aarskog et al 2000). Röviden: teljes vérből izolált DNS-t vizsgáltunk, referencia génként albumint használtunk. A primerek szekvenciáját Aarskog et al (2000) közleményéből vettük át. Minden mintát mind az albumin, mind a PMP22 esetében triplikátumban futtattuk le. A PCR reakció 2x TaqMan Universal PCR Master mixet, 900 nM forward primert, 900 nM reverse primert, 200 nM próbát és 100 ng DNS-t tartalmazott reakciókként. A PCR az ABI Prism 7700 Sequence Detection System-en (Applied Biosystems) futott. A bevezető PCR ciklus kondíciói: 2 min 50°C és 10 min 95°C. Ezt követően 40 cikluson át a következők voltak a paraméterek: 15 sec 95°C, és 1 min 65°C. A PMP22 duplikációt a komparativ Ct módszerrel határoztuk meg.

Roma neuropathiák vizsgálata

A Lom neuropathiában az NDRG1 gén alapító (R148X) mutációját PCR –RFLP módszerrel Echaniz-Laguna et al. (2007) metodikája szerint végeztük el. A CCFDN neuropathiában a genetikai analízis PCR-alapú restrikciós enzim hasítással történt a

Az immunhisztokémiai reakció során csökkent alpha DG jelenlétét mutató betegek izomszövetéből izolált genomiális DNS mintán először a fukutin related protein (FKRP gén) hot spotját (cC826A) zártuk ki Walter et al. (2004)

Varon et al. (2003) által leírt metodika szerint. A mutáció következtében CTDP1 (karboxiterminális domén, RNS-polimeráz II, polipeptid A foszfatáz, 1 alegység) génben a 6. exon-6. intron junctiótól 389. bp-ral az intron irányába C-T szubsztitúció következtében az Nlalll restrikciós enzim hasítási helye elveszett.

Az FKRP mutációk vizsgálata

metodikája szerint. Amennyiben ez a mutáció nem igazolódott az FKRP gén teljes kódoló régióját szekvenáltuk a standard szekvenálási metodikával.

3.2.4. Immunszerológiai vizsgálatok

Az egyes leukocyták arányát FACS módszerrel detektáltuk. Az antikoagulált vér leukocytáit monoclonalis egér anti-human CD4-, CD8-, CD3-, CD56, CD19-FITC antitestekkel festettük. A vörösvértestek lízisét követően a festődött leukocytákat paraformaldehyddel fixáltuk és FACS - Calibur flow cytométerrel analizáltuk. Az egyes fehérvérsejt típusok méretük és granulációjuk alapján különültek el egymástól. A különböző CD markerekkel rendelkező sejtek százalékos arányát 5000 lymphocyta értékelése alapján számítottuk. A serum IgG and autoantitestek szintjeinek meghatározása ELISA módszerrel történt. Az antinuklearis antitest (ANA) meghatározására HEp2 sejtvonal indirekt immunfluorescens assay-t használtunk. A complement factor 3 (C3) és 4 (C4) koncentrációk meghatározása nefelométerrel történt.

3.2.5. Génterápiás vizsgálatok Electroporációs (EP) vizsgálatok

Beta galactosidaset (beta-gal, pCBLacZ), a teljes hosszúságú dystrophint (pCBMuDys) vagy utrophint (pCBVUtrFl) tartalmazó plazmid volt a vektorunk (3.1. Ábra), melyeket a hybrid cytomegalovirus (CMV) és β-actin promoter (CMV promoter) szabályozott. A plazmid pCBLacZ előállítása során pCMV β -nak a β-gal-t kódoló szekvenciáját távolítottuk el (Clonthech Laboratories, Paolo Alto CA, USA) Not1 emésztéssel. Ezt követően a DNS fragmentet XhoI linkerrel (New England, Biolabs) kapcsoltuk, majd a pCAGGS XhoI helyére illesztettük be. A pCAGGS egy olyan plazmid, amely CB promoterrel és SV40 poly(A) adenylációs szignállal rendelkezik. A plazmid pCBmuDYS a teljes hosszúságú rágcsáló dystrophin, a pCBVUtrFl a teljes utrophin cDNS-t tartalmazza.

Mindkettőben a CB a promoter, amelyet a CMV enhancer szabályoz. Az utrophint tartalmazó plazmidban az aminoterminálishoz egy rövid nukleotid

„FLAG tag” lánc kapcsolódik. A pCMVMicroDys microdystrophint tartalmaz, amelyből hiányzik a teljes rod domén, kivéve a 2 spectrin szerű repeatet és az első és utolsó „hinget”. A plazmidokat EndoFree plazmid maxi tisztító kittel (Qiagen

39 Inc, Mississagua, Canada) szabadítottuk meg az endotoxinoktól a gyártó instrukciói szerint. A végső plazmid koncentráció 1-3ug DNS/ul volt.

3.1. Ábra: Az elektroporációs kísérletek során alkalmazott plazmidok felépítése

Rövidítések: AmpR : ampicillin-resistance gene for antibiotic selection in bacteria, ORI: ColE1 az amlifikációhoz a replikáció kezdete az E.Coli-ban. Signal polyA: a nyúl b-globin polyA signal,

5’-ITR: bal (5’) az adenovirus 5 typus invertált terminalis repeatje és packaging signalja, 3’-5’-ITR:

jobb (3’) az adenovirus 5 típus invertált terminalis repeatje, CB Promoter: hybrid CMV enhancer és b-actin promoter, HUMAN DYSTROPHIN: a human dystrophin teljes cDNS szekvenciája

Kezelt állatok, plazmid injekciók és euthanasia: valamennyi állkísérletet a McGill Egyetem állatkíisérlet szabványait követve végeztük. Újszülött (4-6 napos) és felnőtt (6-8 hetes) normális (CD1 and C57BL/6), immunodeficiens (SCID) és mdx egereket használtunk a vizsgálatokhoz. Minden csoportban 4-8 állat volt. A m. tibialis anteriort (TA) vagy a gastrocnaemiust injektáltuk a fenti plazmidok egyikének 50 vagy 20 ul-vel (életkortól függően). Egy kohortban a plazmid injekctiót megelőzően 0,4 U/µl Hyaluronidaset (Sigma Aldrich) is injektáltunk.

Egy további kohortban 100 µl PBS-ben hígított Evans Blue-t (10 mg/ml) fecskendeztünk intraperitonealisan mielőtt a plazmidot injektáltuk. Minden csoportból 4-6 állatot altattunk el 10, 30, 90, 180 és 360 nappal a kezeléseket követően.

Electroporáció (EP): Az injektált izmokat transzkután EP-val kezeltük (felszíni elektród, 8 db négyszög impulzus, 175-1800 v/cm feszültség, 0, 2-20 msec közötti változó időtartam).

A mintavétel és a végpontok meghatározása: altatást követően a teljes TA-t és gastrocnaemiust eltávolítottuk, majd fagyasztott metszeteket készítettünk. A hisztológiai elemzés során az alábbi paramétereket analizáltuk: a transzfekált rostok száma és aránya (β-gal, dystrophin és utrophin pozitivitás), az Evans Blue pozitív rostok száma és aránya, a nekrotikus rostok prevalenciája, a β-gal szint (luminometriás mérés homogenizált izomból) 10, 90, 180 és 360 nappal az EP után. A plazmid partikulumok mennyiségi meghatározása Real-Time PCR-al történt. A DNS-t a fagyasztott metszetekből izoláltuk.

A mintavétel és a végpontok meghatározása: altatást követően a teljes TA-t és gastrocnaemiust eltávolítottuk, majd fagyasztott metszeteket készítettünk. A hisztológiai elemzés során az alábbi paramétereket analizáltuk: a transzfekált rostok száma és aránya (β-gal, dystrophin és utrophin pozitivitás), az Evans Blue pozitív rostok száma és aránya, a nekrotikus rostok prevalenciája, a β-gal szint (luminometriás mérés homogenizált izomból) 10, 90, 180 és 360 nappal az EP után. A plazmid partikulumok mennyiségi meghatározása Real-Time PCR-al történt. A DNS-t a fagyasztott metszetekből izoláltuk.

In document MTA DOKTORI ÉRTEKEZÉS (Pldal 28-0)