Mitokondriális DNS RFLP mintázatok

Ezidáig nem álltak rendelkezésre adatok a hazánkban jelenlév kisspórás Alternaria aggregátum összetételér l. A mtRFLP elemzést fajcsoport azonosítás céljából az alternáriáknál eddig még a külföldi kutatásokban sem alkalmaztak, így ez a módszer új molekuláris információval szolgál a kisspórás Alternaria fajok illetve fajcsoportok azonosítása szempontjából.

A kisspórás Alternaria izolátumok mitokondriális DNS variabilitását vizsgáltuk meg, mivel a mtDNS RFLP elemzése talán az egyik legalkalmasabb módszer a gomba taxonok intra- és interspecifikus elkülönítésére (TAYLOR 1986). A fajok közötti és fajon belüli genetikai polimorfizmus kimutatás szempontjából a mtDNS kedvez alapot biztosít, hiszen kis méret és nagy mutációs rátával rendelkezik szemben a magi DNS-sel.

Ez idáig kevés tanulmány foglalkozik az Alternaria fajok mtDNS analízisével. E régió differenciáltságának tanulmányozása céljából kétféle módszert alkalmaztak: a mtDNS rDNS SSU szekvenálását (PRYOR és GILBERSON 2000) és mtDNS RFLP-t követ Southern

csoporton belüli filogenetikai kapcsolatok vizsgálatára, másrészt a korábban A. alternata-ként ismert HST-termel fajok elkülönítésére összpontosulnak. Az SSU szekvencia elemzés referencia fajai között 1-1 brassicicola, alternata és tenuissima faj szerepel. Mindenesetre egyik tanulmány sem tartalmaz olyan sok fajcsoportot és izolátumot, mint amennyivel mi foglalkoztunk. Ugyanakkor a mtDNS-t alkalmasnak találtuk az egyes fajcsoportok azonosítása céljából.

Nagyobb fokú restrikciós fragmentum-hossz különbségeket tártunk fel az Alternaria nemzetség kisspórás izolátumainak körében. Ilyen különbségeket korábban is azonosítottak valódi gombák mtDNS elemzése során, például a következ faj-aggregátumoknál:

Neurospora intermedia (RIECK és mtsai 1982), Claviceps purpurea (TUDZYNSKI és ESSER

1986), Fusarium oxysporum (KISTLER és BENNY 1987), Trichoderma viride (MEYER 1991), Aspergillus niger (VARGA és mtsai 1993). Ugyanakkor a mitokondriális DNS ilyen fokú variabilitására nem számítottunk, mivel egy korábbi közlemény szerint a mtRFLP-vel vizsgált kisspórás HST-termel Alternaria fajok nem különülnek el az A. alternata-tól (KUSABA és TSUGE 1997). Igaz, hogy az akkor vizsgált hat faj közül vizsgálatunkban csak két HST-termel fajjal, az A. longipes-szel és az A. gaisen-nel (syn. A. kikuchiana) foglalkoztunk. A vizsgálatba vont két HST-t termel faj, mind morfológiailag, mind RFLP típusát tekintve jól elhatárolható volt az A. alternata fajcsoporttól. KUSABA és TSUGE (1997) nem tudott különbséget tenni mtDNS RFLP vizsgálattal e fajok genetikai diverzitását tárgyalva, ez valószín leg az akkor alkalmazott enzim kisebb felbontóképességére vezethet vissza.

Eredményeink alapján a vizsgált mtDNS-ben tapasztalt eltérések enzimenként eltér mintázatot mutattak. Hin 6I emésztéssel öt haplotípust különítettünk el. Közeli alhaplotípusok Ia, Ib és Ic az alternata/tenuissima aggregátumból kerültek ki. Megjegyezzük, hogy az A.

infectoria fajcsoportba tartozó izolátumok mindegyike eltér fragmentum mintázattal rendelkezett, mely alapján az összes e csoportba sorolt egyedre lehetett volna egy-egy haplotípust definiálni. Az általunk megnevezett haplotípusok jellegzetes DNS fragmentummal rendelkeztek, melyek diagnosztikai jelent ség ek az A. alternata/tenuissima aggregátum (Ia, Ib, Ic), az A. longipes (II), az A. arborescens (III), az A. gaisen (IV) és az A. brassicicola (V) fajcsoport elkülönítése szempontjából. Minden izolátum mtDNS mintázata besorolható volt egy-egy fajcsoportba, kivéve két izolátumot a 82-es és a 150-e izolátumokat. A konídiumlánc struktúráját megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a 82-es izolátum alternata-ra jellemz , míg a 150-es izolátum ett l helyenként eltér láncképzést mutat. A morfológiai vizsgálat és az ITS szekvencia-elemzés alapján ezen izolátumokat egy közös A. alternata/tenuissima csoportba soroltuk. Az mtDNS RFLP vizsgálat azonban nem támaszotta alá ezen csoportosításunkat.

Más enzimmel nem tudtunk a fent említett következtetésre jutni. A Bsh1236I enzimmel az alternata, tenuissima, longipes és arborescens fajcsoportok vizsgált egyedei között nem lehetett különbséget tenni. Különböz kombinációban alkalmazott enzimpárosok nem hoztak létre specifikus mintázatot vagy részletesebb információt a mtDNS szervez désér l.

Összehasonlítva a két enzimmel kapott mtDNS mintázatot megállapítható, hogy Hin 6I enzimmel sokkal több markert lehetett el állítani és nagyobb mérték polimorfizmust lehetett kimutatni, mint a Bsh 1236I enzimmel. A Hin 6I enzim differenciáló hatása tehát jobban érvényesült.

Mindenesetre a mtDNS RFLP elemzés típus izolátumokon és hazai izolátumokon egyaránt jelent s genetikai különbségeket tárt fel, mely nagyban megkönnyíti az Alternaria nemzetség kisspórás fajcsoportjainak azonosítását.

A mtDNS RFLP és a RAPD vizsgálati eredményeket összehasonlítva a következ ket állapítottuk meg. El ször, RAPD vizsgálattal több reprodukálható markert lehetett biztonságosan elkülöníteni, mint RFLP vizsgálattal. Ez a különbség a két módszer közötti módszertani különbségek eredménye. RAPD vizsgálattal stabil körülmények között, kis koncentrációjú DNS-t sokszorosan szaporítunk fel RAPD primerek segítségével, szemben az RFLP vizsgálattal, ahol nem végzünk DNS felszaporítást, hanem közvetlenül nagy koncentrációjú DNS-t emésztünk. Másodszor, RAPD vizsgálattal az alternata és tenuissima fajcsoportokat el lehetett egymástól határolni, nem így az RFLP vizsgálattal, mely alapvet en három részre osztotta az alternata/tenuissima aggregátumot. Harmadszor, az RFLP és RAPD vizsgálat egybevágó eredményei alapján megállapíthatjuk, hogy a mtDNS RFLP a RAPD módszert kiváltó egyik alternatíva lehet a kisspórás Alternaria fajcsoportok azonosításának területén. A módszer egyszer bb abból a szempontból is, hogy nincs szükség speciális laborfelszerelésre (pl: PCR készülékre).

Az el z ekb l látható, hogy a hazánkban is széleskör en elterjedt, a kisspórás Alternaria fajokat pontatlanul azonosító A. alternata fajmegjelölés valójában milyen fajcsoportokat takar. Így a kisspórás izolátumok korrekt megnevezése céljából, a SIMMONS -szerinti fajcsoport szint azonosítás mindenképpen javasolt, szemben a NEERGARD-féle csoportosítással.

Összességében a mtDNS RFLP és a RAPD-módszer alkalmasnak bizonyult a hazai Alternaria fajcsoportok és fajok elkülönítésére. Eredményeink összhangban állnak a