Meningeális véráramlás mérés in vivo nyitott koponyaablak preparátumban

A kísérletek kezdetén a patkányokat tiopentál-nátrium intraperitoneális injekciójával, vagy zárt dobozban 5 % izoflurán (Forene, Abbott, Germany) belélegeztetésével altattuk.

A tiopentál-nátriumot 120 mg/kg kezdő dózisban, majd a kísérlet folyamán szükség szerint 25 mg/kg kiegészítő dózisban alkalmaztuk. A kísérlet folyamán fájdalmas ingerrel (a fül megcsípésével) ellenőriztük időről időre az anesztézia mélységét és arra törekedtünk, hogy az állat ennek hatására se mutasson nociceptív motoros reakciókat vagy artériás vérnyomás változást. A tiopentál-nátriummal altatott állatok a kísérlet folyamán trachea kanülön keresztül spontán lélegeztek. Az izoflurán anesztéziát a kísérlet folyamán 2 % izoflurán belélegeztetésével tartottuk fenn kezdetben a fejre helyezett maszkon, később trachea kanülön keresztül.

Az állatok átlagos artériás vérnyomását a jobb oldali arteria femoralisba vezetett kanülön keresztül folyamatosan mértük. Az állatok testhőmérsékletét melegítő lap segítségével 37-37,5 ^oC-on tartottuk. Anyagok szisztémás (intravénás) adása céljából az állatok jobb oldali vena femoralisába is kanült vezettünk.

A meningeális véráramlást a Kurosawa és munkatársai által ismertetett nyitott koponyaablak módszerrel mértük (Kurosawa és mtsai., 1995). Az állatok fejét sztereotaxiás készülékben rögzítettük, a fejtető bőrét a középvonalban megnyitottuk és a koponyát a

parietális területen szabaddá tettük. A koponyacsontot az egyik oldalon a szabaddá tett parietális területen kb. 4x6 mm-es területen fogászati fúróval eltávolítottuk. Eközben a csontot fiziológiás sóoldattal folyamatosan hűtöttük, hogy elkerüljük a szövetek túlmelegedését.

A véráramlást az arteria meningea media ágai fölött, a látható pia mater artériákat elkerülve lézer Doppler áramlásmérővel (Periflux 4001 Master, Perimed, Sweden vagy DRT4, Moor Instruments, UK) mértük. A mérések során vékony mérő szondát (külső átmérő: 1 mm, optikai szálak távolsága: 0,25 mm) használtunk, amelyet közvetlenül az arteria meningea media ága fölé pozicionáltunk. Az ilyen feltételek mellett mért véráramlás értékek döntően a dura mater artériás véráramlás változásairól szolgáltatnak információt. A szabaddá tett dura mater felszínét szintetikus intersticiális folyadékkal (SIF) fedtük, melynek összetétele: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 10 mM glükóz és 10 mM Hepes (pH 7,4). A meningeális véráramlás változásokat a dura mater felszínére topikálisan adott anyagokkal váltottuk ki. A különböző hatóanyagokat 40 µl térfogatban 3, 5 vagy 10 perc időtartamra pipettáztuk a dura mater felszínére. Ezt követően eltávolítottuk és a dura felszínét ismételten átmostuk SIF-kal, amíg az applikáció előtti bazális véráramlás értékek vissza nem tértek. Ez a legtöbb esetben 5-10 perc alatt bekövetkezett. Újabb applikációra csak ezt követően került sor. A véráramlást perfúziós egységekben (perfusion unit, PU) mértük. A véráramlás értékeket és az átlagos artériás nyomás értékeit a használt lézer Doppler áramlás mérő típusának megfelelően vagy a Perisoft számítógépes programmal (Perimed, Sweden) vagy a MoorSoft for Windows (Moor Instruments, UK) programmal rögzítettük és értékeltük ki. A bazális véráramlás értékeket az anyagok applikációját megelőző 3 percben mért véráramlás értékek átlagaként határoztuk meg. A különböző anyagok applikációjával kiváltott véráramlás változásokat a teljes applikációs időtartam (3, 5 vagy 10 perc) egészére vonatkoztatott átlag véráramlásként határoztuk meg, egyes esetekben a percenként vagy két percenként mért értékek átlagát számoltuk ki és a bazális véráramlás szinthez viszonyítva százalékos változásként fejeztük ki.

A különböző neuronális és vaszkuláris lokalizációjú receptorok stimulációjával kiváltott véráramlás változások vizsgálata során a stimulus alkalmazását megelőzően a dura matert előkezeltük a megfelelő receptor antagonistával, bizonyos esetekben a receptor aktiválásában szerepet játszó anyag szintéziséért felelős enzim(ek) inhibitorával. Az előkezelés a különböző gátlószerek 5, 10, 15 vagy 20 perc időtartamú topikális

applikációjával történt. A receptor antagonisták, illetve az enzim gátlók eltávolítását követően a dura SIF-kal történő átöblítése nélkül került sor a megfelelő stimulus alkalmazására. Néhány kísérlet során a stimuláló és/vagy a gátlószereket intravénás injekció formájában juttattuk az állatok keringésébe. Ezekben a méréssorozatokban a receptor agonistának az antagonista/inhibitor applikációját/injekcióját megelőzően és azt követően mért meningeális véráramlásra gyakorolt hatását hasonlítottuk össze.

Az intrakraniális trigeminális afferensek extrakraniális kollaterálisainak kimutatása céljából végzett kísérleteinkben az arteria meningea media ágai fölött mért perfúziót meghatároztuk, majd 20 µl fiziológiás sóoldatot vagy 1 µM capsaicin oldatot injektáltunk lassan (10 sec alatt) a véráramlás méréssel azonos oldalon a musculus temporalisba, a csonthártyához közeli területre. Néhány esetben a ganglion blokkoló hexamethonium kloridot (20 mg/kg fiziológiás sóoldatban, Sigma-Aldrich, Germany) injektáltuk intravénásan, más esetekben a CGRP receptor antagonista kalcitonin gén-rokon peptid 8-37 fragmentumot (CGRP8-37 100 µM, Sigma-Aldrich, Germany) pipettáztuk topikális előkezelés formájában a dura materre a capsaicin injekcióját megelőzően 4 perccel. Ezekben a kísérletekben a capsaicin injekcióját követő 4 percben mért véráramlás átlagértékeket a bazális véráramlással hasonlítottuk össze.

A dura mater kémiai stimulációjával kiváltott centrális és perifériás CGRP felszabadulást vizsgáló kísérleteink során a preparálást megelőzően kanült vezettünk az állatok koponyaablakkal azonos oldali vena jugularisába, melyet 10 U/ml heparin (Ratiopharm, Germany) tartalmú fiziológiás sóoldattal töltöttünk fel. A kanül hegyét kraniális irányban, a vena jugularis bifurkációjának közelében rögzítettük. Ezen kísérletek során a parietális koponyacsont eltávolítását megelőzően a nyakizmokat a középvonalban kettéválasztottuk, majd a ligamentum atlantooccipitale és a dura mater átvágásával megnyitottuk a cisterna cerebellomedullarist (cisterna magna); az agytörzs dorzális felszínét szabaddá tettük véráramlás mérés és likvor minták gyűjtésének céljából. A canalis infraorbitalis-on keresztül vékony szilikon csőhöz csatlakoztatott 27G tűt vezettünk a ganglion trigeminale-ba. A csövet 40 μl 2 %-os lidokain hidroklorid (Xylocain, AstraZeneca, Germany) és 40 μl 0,1 % metilénkék oldatával (Sigma-Aldrich, Germany) töltöttük fel, a két oldatot egymástól 10 μl térfogatú levegő buborékkal elválasztva. A metilénkék oldatot a kísérletek végén, a véráramlás mérések befejezése után juttattuk a ganglionba. Ezt követően a túlaltatott állatokat fiziológiás sóoldattal transzkardiálisan perfundáltuk, a koponyát

felnyitottuk és meggyőződtünk a trigeminális ganglion kék elszíneződéséről, ami a ganglionba vezetett tű megfelelő helyét igazolta. A kísérlet során nyert, lidokain intraganglionáris injekciójának hatására vonatkozó mérési eredményeinket csak a ganglion kék elszíneződése esetén értékeltük ki statisztikailag.

Az in vivo véráramlás mérést követően a kísérletek végén az állatokat tiopentál-nátrium (250 mg/kg i.v.) injekciójával túlaltattuk.

4.6. Kalcitonin gén-rokon peptid felszabadulás mérése ex vivo dura mater preparátumban