Lipázok forrása, azonosítása, ipari termeltetése

Lipáztermelő organizmusok

Köszönhetően széleskörű előfordulásuknak az élőlényekben, a lipáz enzimek változatos forrásból nyerhetők ki. Származhatnak növényből, állatból vagy mikroorganizmusból egyaránt (Gilham és Lehner, 2005). Növényekben a lipáz elsősorban a magok tápanyag raktározó szövetében fordul elő (Mukherjee, 1994). Azonban még viszonylag nagy mennyiségű növényből is csak kevés lipáz nyerhető ki, emiatt a növények nem a legmegfelelőbb enzimforrások (Nagarajan, 2012). Állati eredetű lipázokat izolálhatnak emlősök tejéből, hasnyálmirigyéből, gyomrából, kérődzők szájüregéből. Ezek közül a gyógyszeriparban jelenleg is nagy mennyiségben használják a sertés hasnyálmirigy lipázát (Hasan és mtsi., 2006).

Más emlős lipázok lehetséges terápiás célpontként egyes metabolikus betegségek kezelésében, vagy gyógyszerek közvetlen fejlesztésében jelentősek (Müller és Petry, 2004). A kinyerhető lipáz mennyisége azonban állatok esetében is korlátozott, módosításuk és tisztításuk is nehézkes. Gyakran előfordul, hogy állati vírussal és hormonnal szennyezettek, így élelmiszeripari felhasználásuk korlátozott (Sharma és Kanwar, 2014).

Napjainkban a kereskedelmi forgalomban kapható lipázok túlnyomó többsége mikrobiális eredetű. Az iparban alkalmazott enzimek 88%-a mikrobiális, 8%-a állati és 4%-a

mikrobiális eredetű lipázok ipari felhasználása iránti igény tovább nőtt. Ennek okai az egyre csökkenő előállítási ár, a genetikai módosíthatóság, és a nagy mennyiségben, olcsó szubsztráton történő termeltethetőség (Jaeger és Reetz, 1998; Joseph és mtsi., 2007; Andualema és Gessesse, 2012). Emellett a növényi vagy állati forrásból származó enzimekkel szemben a mikrobiális eredetű enzimek sokkal nagyobb stabilitást mutatnak (Singh és Mukhopadhyay, 2012; Madeira és mtsi., 2017). Különböző fajokkal eltérő szubsztrátspecificitású, hőmérsékleti és pH optimumú enzimeket termeltethetünk (Hasan és mtsi., 2006). A különböző élőhelyekről származó, nagyfokú biokémiai változatosságot mutató enzimek lehetséges forrásai a biotechnológiai folyamatoknak (Lotti és Alberghina, 2007).

A gomba lipázok nagyfokú stabilitása, szelektivitása és széles szubsztrátspecificitása miatt az ipar ezen enzimek irányába fokozott érdeklődést mutat (Yu és mtsi., 2016). Ezeknek a tulajdonságoknak köszönhető, hogy a gomba lipázok a legfontosabb kereskedelmi forgalomban lévő enzimek közé tartoznak (Koblitz és Pastore, 2006). Mivel a fonalas gombák által termelt lipázok főleg extracellulárisak, kinyerésük és további feldolgozásuk könnyebb, így azok enzimforrásként történő hasznosítása preferált az ipar részéről (Ülker és Karaoğlu, 2012; Patel és mtsi., 2017).

Lipázok azonosítása, aktivitásuk meghatározása

Mikrobiális lipáz enzimek azonosítására számos technika áll rendelkezésre (Hasan és mtsi., 2009). Legkönnyebben magas zsír-, és/vagy olajtartalmú élőhelyekről izolálhatunk lipáztermelő fajokat (pl. sajtok felszínéről, szennyvíziszapból, olajpréselő üzemek melléktermékeiről, komposztból) (Andualema és Gessesse, 2012). Alacsony hőmérsékleten is aktív lipázokat tartósan hideg élőhelyekről, elősorban sarkvidéki környezetből (talaj, jég), mélytengerekből, fagyasztott élelmiszerek felületéről származó mikrobákból lehetséges izolálni (pl. C. antarctica, A. nidulans) (Joseph és mtsi., 2007).

A lipáztermelő képesség vizsgálatának egyik fő meghatározója, hogy ezen fajok képesek az olaj/zsír szubsztrátok egyedüli szénforrásként történő hasznosítására. Nagyszámú izolátum lipáztermelésének egyidejű tesztelésére gyors és egyszerű módszer a Tween 80 vagy tributirin szubsztrát tartalmú agar lemezeken történő tenyésztés. A szubsztrát lipáz általi lipolízisének hatására a telepek körül keletkező feltisztulási zónák jelenlétéből és méretéből következtethetünk a lipáztermelés mértékére. A módszer hátránya, hogy ezen szubsztrátokat nem kizárólag a lipáz enzimek, hanem az észterázok is képesek hidrolizálni, emiatt valódi lipázok azonosítására további célzott aktivitás-meghatározó, megerősítő mérések elvégzése

szükséges (Gupta és mtsi., 2003). Szintén gyakran alkalmazott kvalitatív módszer az olívaolaj tartalmú táptalaj és Rhodamine B fluoreszcens festék használata lipolitikus fajok azonosítására.

A Rhodamine festék fluorszcens komplexet képez a szabad zsírsavakkal, így UV fény hatására a lipáztermelő törzsek telepei körül fluoreszcens zóna figyelhető meg (Hasan és mtsi., 2009).

Számos módszer létezik a lipázaktivitás kvantitatív meghatározására, melyek a szubsztrát fogyását, vagy a termék felszabadulását monitorozzák. Gyakran használt mérési módszer a titrimetria, leggyakrabban trioleát, vagy olívaolaj hidrolízise során felszabaduló zsírsavak meghatározására (Yu és mtsi., 2016). A módszer megbízható, pontos, de rendkívül időigényes eljárás. A leggyakrabban alkalmazott hidrolitikus aktivitás meghatározó módszerek közé tartozik a kromogén szubsztrátokkal történő kolorimetriás aktivitás meghatározás (pl. p-nitrofenil-észterek vagy naftil-észterek alkalmazásával). A p-p-nitrofenil-észterek (pNF-észterek) esetében a lipázaktivitásnak köszönhetően p-nitrofenol, míg naftil-észterek esetében naftol szabadul fel, melyek színes termékek. Előnyei, hogy a keletkező színes termék könnyen detektálható fotométerrel (410 és 560 nm hullámhosszon). A módszer gyors és viszonylag olcsó, valamint változatos szénlánc-hosszúságú szubsztrátok állnak rendelkezésünkre a kereskedelmi forgalomban (Gupta és mtsi., 2003). A fluoreszcencián alapuló mérések lényege, hogy az enzimatikus reakció során a keletkező termék floureszcens jelet bocsájt ki, mely UV fényben mérhető, pl. pirén tartalmú triglicerid analógok, metilumbelliferil szubsztrátok segítségével (Gilham és Lehner, 2005). A különböző kromatográfiás eljárásokkal történő aktivitás meghatározás időigényes és költséges módszer (drága műszerek és sztenderdek szükségesek); ilyenek a HPLC (high performance liquid chromatography) és GC (gas chromatography) analitikai mérési módszerek (Fu és mtsi., 2014). A szintetikus aktivitás meghatározására ugyanakkor e technikák alkalmazása terjedt el leginkább (Teng és Xu, 2007;

Yu és mtsi., 2016).

Az utóbbi néhány évben újfajta megközelítés vált népszerűvé enzimek azonosítására. A metagenom analízis során egész mikrobiális közösség térképezhető fel ismert enzimeket kódoló génszekvenciák hasonlósági keresésével. A környezeti mintából létrehozott génkönyvtár fő előnye, hogy a laboratóriumban nem, vagy nehezen tenyészthető fajokból is azonosíthatók új enzimek (Simon és Daniel, 2011; Sahoo és mtsi., 2016).

Tenyésztési és termelési körülmények

A lipáz enzimek jellegzetes metabolikus folyamat részei, így génjeik kifejeződése

mtsi., 2011), gombák esetében gyakran induktor jelenléte szükséges (Falony és mtsi., 2006).

Jelentős lipáz expresszióhoz lipid induktor jelenléte mellett megfelelő fiziológiai paraméterek (pH, hőmérséklet és oxigénszint) is szükségesek (Gupta és mtsi., 2004). Ezen kívül a szén- és nitrogénforrás típusa és koncentrációja, valamint a tápközegben jelen lévő ásványi sók, fémionok is hatással vannak az enzimtermelésre (Sharma és mtsi., 2001).

A mikrobiális lipázok ipari termeltetésére elsősorban a süllyesztett, folyadék tenyészet (SmF: Submerged Fermentation) alkalmazása az elterjedt, azonban a szilárd tápközegen történő előállítás is előfordul (Aravindan és mtsi., 2007). A folyadék fázisú fermentáció főbb előnyei:

i) szabad víz jelenléte a tenyésztőközegben, ii) könnyű kezelhetőség nagy mennyiségben történő termelés esetében is, iii) valamint a tenyésztési körülmények (hőmérséklet, pH, oxigén szint) egyszerűbb kontrollálása (Patel és mtsi., 2017). Azonban a szilárd fázisú fermentáció (SSF: Solid State Fermentation) alkalmazása is számos előnnyel rendelkezik: egyszerűbb és olcsóbb tenyésztőközeg, nagyobb mennyiségű, koncentráltabb termék képződése jellemzi, valamint a szilárd szubsztrát nemcsak tápanyagot szolgáltat, hanem vázként is funkcionál a sejtek növekedéséhez (Pandey és mtsi., 1999; Rajan és Nair, 2011). Ez utóbbi tényező elsősorban a fonalas gombák növekedésének kedvez. Emellett a mezőgazdasági maradványok szubsztrátként történő hasznosítása környezetbarát eljárás, ugyanis ezen növényi maradványok a mezőgazdasági tevékenységek során minden évben nagy mennyiségben keletkeznek, megújulók, így újrafelhasználásuk csökkenti felhalmozódásukat (Ray és Behera, 2017; Madeira és mtsi., 2017). A szilárd szubsztrát megválasztásánál fontos szempont a szemcseméret. A túl kicsi partikulum méret a szubsztrát összetapadását okozhatja, ezáltal a levegő áramlása akadályozott, míg a túl nagyméretű szemcsék limitált növekedési felületet eredményeznek.

Emellett az SSF esetében kritikus a megfelelő vízaktivitás (aw) beállítása és kontrollálása, ugyanis annak szintje befolyásolhatja a mikrobiális aktivitást (Patel és mtsi., 2017).

A lipázok ipari folyamatokban biokatalizátorként történő alakalmazását övező növekvő érdeklődés ellenére felhasználásukat gyakran a magas termelési költségek korlátozzák. Ennek érdekében szükséges a megfelelő tenyésztési körülmények, szubsztrátok enzimtermelésre gyakorolt hatásának vizsgálata, mely lehetővé teszi az enzim előállítási költségeinek mérséklését (Salihu és mtsi., 2012).