Kutatócsoporti előzmények

A MTA-SZTE Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoportjában az SPR spektroszkópiai vizsgálatok 2012 óta egyre meghatározóbb szerepet kaptak. A 2017 évben elnyer újabb pályázatnak köszönhetően jelenleg a MTA-SZTE Biomimetikus Rendszerek Kutatócsoportjában folynak a kvázi kétdimenziós szenzortechnika által végzett vizsgálatok. A csoportban készült doktori értekezések sorában jelen dolgozat az első, amely makromolekulák és kismolekulás hatóanyagok közötti kölcsönhatások SPR méréstechnika általi modellezését mutatja be. A kísérleti munka elvégzéséhez a SZTE Fizikai Kémiai és Anyagtudományi Tanszékén működő, egyedi tervezésű kétcsatornás hullámhossz modulált SPR platform (7. ábra) biztosította az elsődleges műszeres hátteret. A 7. ábra fotóin feltüntetett számok rendre az alábbi egységeket jelölik: 1. perisztaltikus pumpa, 2.

29 polarizátor, 3. a prizmát, a szenzor chip-et és a mintakamrát befogó szerkezet, 4.

spektrofotométer és száloptikája, 5. fényforrás, 6. szenzor chip, 7. a mintakamrákat és az áramlási csatornákat egybefoglaló fedél szétszerelt, valamint összeszerelt (8.) és rögzített (9.) állapotban.

7. ábra: A SZTE TTIK Fizikai Kémiai és Anyagtudományi Tanszéken működő két- csatornás hullámhossz modulált SPR platform fotói

Az említett berendezés üzembe helyezése után az első publikált eredmény a dopamin és az IBU L-ciszteinnel funkcionalizált arany felületre történő szorpciójának vizsgálata volt.

A közleményben a szenzorgramok állandósult állapothoz rendelhető telítési szakaszai alapján meghatározott adszorpciós izotermákról és a számított izoszter adszorpciós hőmennyiség alakulásáról számoltak be a kutatócsoport munkatársai [56]. A kiértékelési módszer alapját a szenzorgramok által meghatározott és felületegységre vonatkoztatott adszorbeált anyagmennyiségek (Γ) egyensúlyi koncentrációtól való függése szolgáltatta.

Ennek ismeretében a tetszőleges felületi borítottsághoz¹⁹ (θ) rendelhető egyensúlyi koncentráció értékek hőmérsékletfüggése alapján számíthatóvá vált a gyógyszerhatóanyagok adszorpcióját kísérő izoszter entalpiaváltozás (ΔH⁰ad) [57]. Az MTA-SZTE Idegtudományi Kutatócsoportja által indított, a KYNA szerepének és hatásmechanizmusának felderítésére irányuló projekthez kapcsolódva 2014-ben jelent meg az első olyan publikáció, amelyben AMPA receptort modellező polipeptidekkel (GluR1 201-230 és GluR1231-259 jelölésű szakaszok) funkcionalizált szenzorral végzett vizsgálatok kerültek bemutatásra [58]. Ehhez a projekthez kapcsolódva kezdtem el 2015-ben azt a

19 A felületi borítottság (θ) adszorbeálódó komponens adszorbeált többlete (n^s) és a monomolekulás borítottsághoz tartozó adszorbeált anyagmennyiség (n^sm) hányadosa. Állandó hőmérsékleten a felületi borítottság és az adszorptívum oldatfázisbeli koncentrációja között a kísérleti izotermákra illeszthető 𝜃 = 𝑐 (𝐾 + 𝑐)⁄ összefüggés állhat fenn.

30 kutatási munkát, amely során egy új korábban elő nem állított AMPA receptort modellező polipeptid (GluR1270-300) és KYNA kölcsönhatásának SPR technika általi modellezése volt feladatom.

2.3.1. Az AMPA receptort modellező polipeptidek szintézise és karakterizálása

A receptor modellként felhasznált polipeptidek kereskedelmi forgalomban nem szerezhetők be. Szintetikus úton történő előállítása során, a kiválasztott és Fmoc²⁰-csoporttal védett aminosavak, szilárdfázisú peptidszintézis útján kerültek összekapcsolásra. A szilárdfázisú szintéziseket és a liofilizált termékek szemipreparatív fordított fázisú HPLC (Phenomenex Jupiter Proteo, C18, 10 μm,15 x 250 mm) eljárással kivitelezett tisztítását Dr.

Szolomájer János (SZTE ÁOK Orvosi Vegytani Intézet) végezte. A peptidek moláris tömegének meghatározását célzó, Finnigan TSQ-7000 típusú hármas-kvadrupól készülékkel kivitelezett tömegspektrometriás (MS) vizsgátokat Dr. Kele Zoltán (SZTE ÁOK Orvosi Vegytani Intézet) végezte.

Az ismert szerkezetű AMPA receptor négy alegysége [59,60] közül az 1-es alegység modelljeként két aminosav lánc került előállításra. A 201-es valintól a 230-as leucinig terjedő, VVDCESERLNAILGQIIKLEKNGIGYHYIL aminosav sorrendű és GluR1201-230

jelölésű polipeptid, amelynek számított moláris tömege M = 3210,61 g mol^-1, míg az MS technikával meghatározott érték M = 3209,98 g mol^-1. Emellett pedig a 231-es alanintól a 259-es treoninig terjedő, ANLGFMDIDLNKFKESGANVTGFQLCNYT aminosav sorrendű és GluR1231-259 jelölésű szakasz. Utóbbi számított moláris tömege M = 3400,97 g mol^-1, míg az MS technikával meghatározott érték M = 3400,56 g mol^-1. A fragmensek szintézise és karakterizálása mellett az arany felületre kötött szekvenciák és a KYNA között kialakuló kötés analízisét molekuladinamikai (MD) szimulációk révén Dr. Bogár Ferenc (SZTE ÁOK Orvosi Vegytani Intézet) végezte.

Az NMDA és az AMPA típusú glutamátreceptorok és KYNA valamit KYNA analógok kölcsönhatását modellező, kvantumkémiai szerkezet és affinitás szimulációk csupán az NMDA receptor esetén álltak rendelkezésre [61]. Ezáltal az elméleti kémiai számítások mindenképp szükségesek voltak és ezek eredményei kiindulási alapul szolgáltak a szenzorikai vizsgálatok tervezése és kiértékelése során. A GluR1201-230 és GluR1231-259

polipeptidek szerkezete a LOMETS²¹ (Local Meta-Threading-Server) nevű on-line

20 9-Fluorenil-metiloxi-karbonil-klorid

21 https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/LOMETS/

31 szolgáltatás révén generálódott, amely negyedleges szerkezet szintű becslést tesz lehetővé [62].

2.3.2. Az SPR szenzor felületének funkcionalizálása AMPA receptort modellező polipeptidekkel

A kutatócsoport munkatársai két eltérő szekvenciájú polipeptiddel funkcionalizált SPR szenzor kialakítása során a fiziológiás körülményeket közelítő, neutrális (pH = 7,4) kémhatású foszfát pufferben (PBS) oldott, c = 30 µM koncentrációjú polipeptid-oldatot áramoltattak (qv = 50 µL perc^-1) a szenzor arany felülete felett, majd állandósult állapotnak megfelelő szenzorjel elérését követően a puffer ismételt átáramoltatása révén távolították el a felesleges polipeptidet. A szenzorjel pufferes lemosását követő és a polipeptid injektálását megelőző értéke közötti eltérés alapján valószínűsíthető volt, hogy a fragmensek irreverzibilis módon kötődnek a szenzor felületéhez. Az irreverzibilisen kötött polipeptid réteg kialakulása a szenzor arany felülete és a peptidek 204-es illetve a 256-os helyzetű ciszteinjének kéntartalmú funkciós csoportja között kialakuló kovalensen kötésnek köszönhető [56]. A receptor modellel módosított szenzorfelület kialakítását követően a korábban alkalmazottal azonos összetételű pufferes közegű KYNA oldatokat vezettek a szenzorfelületre. Az oldatsorozat egyes tagjaiban a KYNA koncentrációja 0,1 és 5,0 mM között változott a méréseket pedig 10 és 40 C° közötti hőmérséklet tartományban, négy különböző hőmérsékleten végezték el. A koncentráció és hőmérsékletfüggő szenzorgramok asszociációs telítési szakaszához rendelhető hullámhossz eltolódás értékek alapján, meghatározásra kerültek a KYNA szorpciós izotermái. A kísérleti úton meghatározott adatpárok izoterma egyenlettel történő illesztését követően tetszőlegesen választott θ érték mellett vált számíthatóvá az adott borítottsághoz rendelhető entalpiaváltozás (ΔH⁰ad).

Mindezek ismeretében a kölcsönható partnerek sztöchiometriai arányának függvényében is vizsgálhatóvá vált a szorpciós folyamatot kísérő hőeffektus, amelynek extrémuma (ΔH⁰ad ≈

−40 kJ mol^-1) θ ≈ 1 borítottság, valamint 1,0:1,3 receptor:ligandum mólarány esetén jelent meg. A szenzorgramok kinetikai modell általi kiértékelése, a megfelelő szoftveres kiértékelési eljárás hiányában egyik polipeptid fragmens esetében sem került kivitelezésre.

32