KUTATÁSI CÉLOK

A sebészeti kezelés mellett a gyógyszeres kezelés súlya folyamatosan nő. A teljes test valamennyi sejtjét elérő („szisztémás”) kezelés előnye, hogy a rejtve maradó izolált tumorsejteket is el tudja érni. Ezen szisztémás kezelés további javítása két módon lehetséges.

Az első lehetőség új, hatékonyabb gyógyszerek kifejlesztése, amelyek a jobb terápiás válaszadási arány mellett a túlélést, illetve az életminőséget jelentősen javítani tudják. Ezen opcióval foglakozik valamennyi gyógyszergyár, illetve az akadémiai kutatás jelentős része is.

A második, általunk is vizsgált lehetőség a "személyre szabott terápia" alkalmazása, vagyis a rendelkezésre álló lehetőségek közül az adott beteg számára legmegfelelőbb gyógyszer vagy kezelési protokoll kiválasztása. Az új gyógyszer fejlesztésével szemben ezen megközelítés előnye, hogy a sokkal alacsonyabb költségigény mellett az egyén szintjén a legjelentősebb javulást (új gyógyszerek alkalmazása esetén is) csak a személyre szabott kezeléssel lehet elérni.

Vizsgálataink során onkológiai biomarkerek kutatásával foglalkoztunk. Ezen belül három fő célt tűztünk ki, úgymint:

1. a legjobb biomarker-jelöltek azonosítása transzkriptom szintű adatok alkalmazásával sejtkultúra alapú kísérletekben

2. korábban azonosított biomarkerek igazolása transzkriptomikus adatok keresztelemzésével és klinikai mintákon való teszteléssel

3. bioinformatikai eszközök fejlesztése, amelyek a transzkriptomikus adatok alkalmazását lehetővé teszik további biomarkerek vizsgálata során is.

Ezen három fő célkitűzés egyes kérdéseit azonban árnyalja, hogy egyrészt biomarkereket több tumortípus és több gyógyszer esetén vizsgáltuk, illetve a transzkriptomikus technológiák is különbözőek voltak az egyes vizsgálatokban. Az alábbiakban az egyes pontokhoz tartozó konkrét kérdéseket külön is részletezzük.

26

2.1. A legjobb biomarker-jelöltek azonosítása genom-szint ű adatok alkalmazásával in vitro kísérletekben

2.1.1. Kemoterápiás szerekkel szembeni rezisztencia-profil meghatározása sejtvonalak vizsgálatával

Ezen első, transzkriptom szintű adatot is alkalmazó vizsgálat során a célunk az volt, hogy az egyes tumortípusoktól függetlenül tudjunk kemorezisztencia-biomarkereket azonosítani. Figyelembe véve, hogy az elképzelések alapján a tumorok általában hasonló rezisztencia-mechanizmusokat alakíthatnak ki, ezért arra törekedtünk, hogy nagyszámú sejtvonal egyidejű vizsgálatával olyan markereket azonosítsunk, amelyek a rosszindulatú daganatos betegség típusától függetlenek. A kutatás során célunk volt, hogy összesen 30 különböző sejtvonal génexpressziós mintázatának felhasználásával 11 rákellenes gyógyszerrel szembeni rezisztencia-géneket meghatározzuk.

2.1.2 A kemorezisztencia génjei melanoma malignumban

Rendelkezésünkre állt egy szülői melanoma sejtvonal (MeWo), valamint ennek négy különböző gyógyszerrel szemben rezisztenssé tett leányvonala. A vizsgálatok során célunk volt a szülői- és leányvonalak génexpressziós mintázatát meghatározni, hogy ezáltal olyan géneket tudjunk azonosítani, amelyek az egyes gyógyszerekkel szembeni rezisztenciával kapcsolatba hozhatóak.

2.1.3. Várható túlélés előrejelzése sejtkultúra modellben azonosított gének felhasználásával Kutatásaink során célunk volt sejtkultúrás modell rendszerben kemoterápiával szemben ellenálló és érzékeny sejtvonalak génexpressziós mintázatának összehasonlítása, hogy egy olyan mintázatot azonosítsunk, amellyel klinikai betegekben is tudunk előrejelzést adni a várható terápiás választ illetően. Összesen négy különböző tumortípust vizsgáltunk egyidejűleg, hogy az egyes szövettípusoktól függetlenül csak a kemoterápiás válasszal kapcsolatba hozható géneket tudjuk azonosítani. Végezetül az adott gyógyszer (doxorubicin) monoterápiájával kezelt betegek elemezésével teszteltük modell rendszerünk hatásosságát.

2.1.4. Transzkriptomikus adatokkal meghatározott gének oki szerepének igazolása kísérletes körülmények között

27

A kutatás során elsődleges célunk volt gén chip technológia alkalmazásával a doxorubicin-rezisztenciával kapcsolatba hozható proteaszóma-alegységek azonosítása. A projekt második fázisában ezen alegységek rezisztenciában betöltött szerepét kísérletes módon akartuk igazolni, amelynek során a PSMB7 gén elcsendesítésével egyidejűleg alkalmazott gyógyszeres kezelés mellett mértük az életben maradt sejtek arányát. Végső célunk volt, hogy a fentebb már leírt kutatási folyamat egy kiterjesztett verziójával a rezisztencia egy olyan oki génjét tudjuk azonosítani, amely akár gyógyszerekkel is befolyásolható lehet, és ezáltal egy kombinált kemoterápiás kezelés alapját adhatja.

2.1.5. Parallel evolúciós modell alkalmazása a párhuzamosan létrejövő kemorezisztencia modellezésére

A fentebbi kérdések alapfeltevése az volt, hogy azok a mechanizmusok, amelyek klinikailag valóban jelentőséggel bírnak, több sejtvonalban is hasonló módon aktiválódhatnak. Felvetődik ezek után további kérdésként, hogy ha a korábbi kisebb vizsgálatok helyett relatíve nagyszámú párhuzamos sejtvonalat fejlesztünk ki ugyanabból a genetikailag azonos ősből, akkor igazolni tudjuk-e a rezisztencia legmegbízhatóbb markereit?

2.1.6. Célzott terápiás szerekkel szembeni rezisztencia és érzékenység vizsgálata

Az 1.-5. cél kutatása során hagyományos citotoxikus terápiákkal szembeni rezisztencia markereit kerestük. Kérdés, hogy az egyes jelátviteli utak modulálásán keresztül ható célzott terápiás szerekkel szembeni rezisztencia markereit is tudjuk-e azonosítani nagyszámú sejtvonal felhasználásával elvégzett sejtkultúrás mérések alapján. A legjobb biomarker-jelöltek azonosítása mellett célunk volt ezen gének igazolása független klinikai mintákon is.

2.2. Korábban azonosított biomarkerek igazolása transzkriptom szint ű adatok keresztelemzésével és klinikai mintákon való teszteléssel

2.2.1.

Kutatásaink alaphipotézise alapján a melanoma pathogenezisével összefüggő gének közül a legmegbízhatóbb géneket akkor tudjuk azonosítani, ha több vizsgálat

28

eredményeit is felhasználjuk. Ezért a vizsgálat során célunk volt az elérhető transzkriptomikus adatok alapján azonosított biomarkerek összehasonlítása és a hozzájuk rendelhető gén-ontológiai kategóriák meghatározása egy keresztelemzés során.

A kutatás további feltételezése volt, hogy nem szükséges az alapadatokat minden esetben ismernünk, elég a kutatások végeredményét elemezni.

2.2.2. Korábbi közleményekben emlőrák prognózisával kapcsolatba hozott génlisták kereszt-elemzése nyers adatok újrafeldolgozása után

A korábban közölt prognosztikai szereppel is bíró génlisták független klinikai anyagon való tesztelése nem megoldott. A kutatás során célunk volt a transzkriptomikus adatok összerendezése egy adatbázisba, majd ezen adatbázis felhasználásával prognosztikus génlisták független tesztelésének elvégzése. Végezetül meg akartuk vizsgálni, hogy az adatbázis felhasználásával lehetséges-e a korábbiaknál hatékonyabb előrejelző biomarkereket azonosítani?

2.2.3. Petefészekrákok szövettani altípusait meghatározó és a várható túlélést előrejelző gének azonosítása

A kutatás során a korábbi megközelítések helyett egy fordított kutatási tervet készítettünk: először nagy in silico adatbázist építettünk, amelyen a szövettani altípusokkal és a túléléssel összefüggő géneket azonosítottuk. Eközben klinikai mintagyűjtést folytattunk a Semmelweis Egyetemen és az Országos Onkológiai Intézetben. A klinikai mintákon a gén chipek segítségével azonosított géneket egy független technológia (RT-PCR) alkalmazásával akartuk igazolni.

2.3. Bioinformatikai eszközök fejlesztése, amelyek a transzkriptomikus adatok alkalmazását lehet ő vé teszik további biomarkerek vizsgálata során

2.3.1. Microarray adatok előfeldolgozása

Ezen módszertani vizsgálat során célunk volt az általunk két különböző platformon (gén chip és RT-PCR) meghatározott minták felhasználásával az előfeldolgozási algoritmusok egymáshoz viszonyított teljesítményét kiszámolni. A projekt végső célja az volt, hogy a további kísérletes és keresztelemző kutatások során ezen általunk igazolt legjobb algoritmust tudjuk a számítások során felhasználni.

29

2.3.2. Online rendszer fejlesztése az emlőrák prognózisát előrejelző génexpresszió alapú biomarkerek tesztelésére

A kutatás során célunk volt a rendelkezésünkre álló gén chip adatokra építve egy olyan online elérhető rendszert kifejleszteni, ahol egy tetszőlegesen kiválasztott gén expressziójának az egyes betegekben mért szintje és a betegek várható kiújulás mentes és teljes túlélése közötti kapcsolatot lehet vizsgálni. A rendszerbe olyan sok beteget akartunk integrálni, amennyi lehetővé teszi, hogy egyes ritkább alcsoportokban is megbízható statisztikai számítást lehessen végezni. A program létrehozása után a korábban leírt biomarker jelöltek közül a legígéretesebbek vizsgálatával demonstráltuk a software alkalmazhatóságát.

2.3.3. A világhálón keresztül elérhető keresztelemző rendszer továbbfejlesztése többgénes osztályozók és optimalizált vágópont számítására

Az előző pontban említett Kaplan-Meier rajzoló programot továbbfejlesztettük, hogy több gén egyidejű mérésére alkalmas legyen és lehessen a vágópontot optimalizálni. A fejlesztés során petefészekrák mintákat használtunk fel, és a fentebb leírt rendszerrel párhuzamosan létrehoztunk egy második elemző oldalt.

2.3.4. A világhálón keresztül elérhető diagnosztikai rendszer fejlesztése

A kutatás célja egy, a világhálón keresztül elérhető diagnosztikai rendszer fejlesztése volt, amely a betegből eltávolított tumorszövet feldolgozásával készült gén chipek segítségével direkt betegdiagnózis készítésére alkalmas. A rendszerbe elsőként a három legelterjedtebb vizsgálatot (ösztrogén receptor, HER2 státusz, 21 génes „recurrence score”) terveztük beépíteni, majd nagy mintaszámon akartuk a hatásosságot ellenőrizni. Az utolsó feladat a rendelkezésre álló nagy adatbázis alapján egy, a korábbiaknál hatásosabb saját algoritmus fejlesztése volt.

30