4. Eredmények és azok megbeszélése
4.2. Kringle domének funkcionális jelentősége a plazmin aktivitásában fibrinogénen és
A plazmin, miniplazmin és mikroplazmin fibrin felszínen kifejtett hatásaiban jelentős eltérések tapasztalhatók, ahogy az az előző fejezetben ismertetésre került. E három proteáz jól körülírt szerkezeti különbségeik és azonos proteáz doménjük miatt kiválóan alkalmazhatók modell molekulákként a szerkezet-funkció kapcsolatok tanulmányozásában.
A fibrinogén és fibrin iránti proteáz affinitást korábban bevezetett kompetición alapuló módszerünkkel értékeltük [XXXIV]. E szerint a proteáz egyszerre két szubsztrátra hat (Spectrozyme-PL és fibrinogén vagy fibrin) és a Spectrozyme-PL lebontási sebessége
max.
nemcsak a szintetikus szubsztrát koncentrációjától (S) és a rá jellemző
kinetikai paraméterektől (KMSS és Vmax) függ, hanem a kompetáló fehérje koncentrációjától (Fg) és Michaelis állandójától (KMFg). Méréseink során megbizonyosodtunk, hogy emelkedő fibrinogén vagy fibrin koncentráció mellett a proteázra jellemző maximális reakciósebesség (Vmax) nem változik, csak a Spectrozyme-PL-re vonatkozó látszólagos
Michaelis állandó emelkedik, ami megfelel a fenti egyenlettel leírt kompeticiónak. Az így meghatározott KMFg értékeket a 3. táblázat foglalja össze. A KM alapján fibrinogén iránt a plazmin affinitása a legnagyobb, míg a miniplazmin és mikroplazmin KM értékei között nincs szignifikáns különbség. A vizsgált proteázok közül 2 mM 6AH csak a plazmin KM
értékét változtatja meg úgy, hogy az a mini- és mikroplazminéhoz hasonlóvá válik. Ezek az adatok az 1.-4. kringle domének szerepére utalnak a plazmin-fibrinogén komplex kialakulásában. Egy fibrinogén molekula négy plazminogént tud kötni és minden egyes plazminogén csatlakozása után a következő plazminogén egyre nagyobb affinitással kötődik [131]. Ez a pozitív kooperativitás érvényesülhet plazmin esetében is és feltehetőleg az 1.-4. kringle domén jelenlététől függ, ami az alacsonyabb KM értékben nyilvánul a miniplazminhoz képest. Az összes vizsgált proteáz fibrinre vonatkozó KM értéke egy nagyságrenddel alacsonyabb mint fibrinogén szubsztráton és ez független a kringle domének jelenlététől. Ugyanakkor a PMN-elasztáz és katepszin G, amelynek katalitikus doménje eltér a plazminétól, magasabb KM-mel rendelkezik fibrinre nézve (0,4 μM körüli a korábbi eredményeink szerint [XXXIV]), ami ugyanúgy a proteáz domén jelentőségét támasztja alá a fibrin-enzim komplex kialakulásában, ahogy az előző fejezetben ismertetett fibrin felszínen nyert kinetikai paraméterek alapján is erre konkludáltunk. A rostokba rendezett fibrin monomerek konformációs szabadsága kisebb a fibrinogénhez képest, így a már említett pozitív kooperativitás nem érvényesülhet a kötődésben és a kringle doménektől függetlenül az azonos, vagy hasonló katalitikus doménnel rendelkező proteázok KM értéke közel egyforma. E mellett a fibrinogén-fibrin átalakulás során a plazmin kötőhelyek konformációja megváltozhat, ami nagyobb affinitást eredményez.
3. táblázat: Fibrinogén és fibrin degradáció kinetikai paraméterei
A [IV] mellékletben meghatározott paraméterek kerültek feltűntetésre. A „KM6AH” 2 mM 6AH mellett mért értékeket jelöl.
A fibrin kcat értékének meghatározásához az általunk korábban [XXXIV]
bevezetett módszert használtuk, amely során a fibrin oldása során csökkenő turbiditást és egy adott turbiditás szinthez tartozó intakt fibrin mennyiséget mértük. Mivel az összes vizsgált proteáz KM értéke 0,1 μM nagyságrendű és a használt fibrin monomer
koncentrációja 6 μM, a reakciók vizsgált szakaszában az enzimek végig telítve vannak szubsztráttal. Így egy adott fibrin szint (Fne) eléréséhez eltelt idő (te) és az enzimkoncentráció (E) között a következő összefüggés áll fenn 0
. meghatározáshoz felhasznált adatokat a 10. ábra mutatja be.
10. ábra: Fibrinoldás katalitikus állandójának meghatározása turbidimetria alapján.
[IV]
A vizsgált proteáz (●, plazmin; ■,miniplazmin; ▲, mikroplazmin; ▼, tripszin) a trombinnal együtt került be a fibrinogén oldatba és így a fibrin keletkezése előtt egyenletesen eloszlott a feltűntetett végkoncentrációkban. A betétábrákon bemutatott A340 görbék alapján regisztráltuk a maximális abszorbancia felezéséhez szükséges lízis-időt (szimbólumok) és ezekhez az adatokhoz illesztettük a
0
= − egyenlet alapján a kcat értékét (a legjobb illesztést a görbék prezentálják).
Betétábrák: a fibrin keletkezése és feloldása során fellépő turbiditás változások 60 nM mikroplazmin (bal) vagy 8 nM plazmin (jobb) hatására. A szaggatott vonalak 2 mM 6AH mellett végzett méréseket mutatnak be.
Fibrinogén esetében a kcat meghatározásához alkalmasnak bizonyult a Módszerek fejezetben felvázolt eljárás, amely etanolos kicsapás után az oldatban maradó peptid termékeket detektálja [IV]. Mivel kezdeti reakciósebességet nem tudtunk megbízhatóan mérni, az eredmények értékeléséhez a Michaelis-Menten egyenlet integrált formáját használtuk 0 kezdeti fibrinogén koncentráció; S, adott időpontban mért etanol-szolubilis termékek levonása után fennmaradó fibrinogén koncentráció). Egy reprezentatív meghatározást a 11.
ábra mutat be.
11. ábra: Fibrinogén emésztés katalitikus állandójának meghatározása etanol-szolubilis termékek keletkezése alapján. [IV]
A fibrinogént 5 (▼), 10 (■), 15 (▲) vagy 20 (●) nM plazminnal emésztettük és a feltűntetett időpontokban etanolos kicsapás után mértük a felülúszó abszorbanciáját 280 nm-nél (betétábra). Az adatok alapján kiszámoltuk a fentiekben ismertetett fS függvény értékét és a fS=kcat. .E t egyenlethez illesztettük a kcat értékét.
Az így nyert kcat értelmezésénél figyelembe kell venni, hogy a meghatározás elvéből kifolyólag, az állandó nem egy konkrét kötés hidrolízisének sebességét jellemzi, hanem fibrinogén esetében a kisebb méretű, alvadékot nem képező termékek keletkezését, fibrin esetében pedig a vízoldékony termékek leválását. Tehát mindkét szubsztráton az emésztés globális folyamatának jellemzője és pontosan ezért lehet a kcat/KM arányt használni a különböző proteázok katalitikus hatékonyságának összehasonlítására. A fibrinogénen és fibrinen meghatározott hatékonyság alapján (3. táblázat) azt a következtetést lehet levonni, hogy mind a négy vizsgált proteáz hatékonyabb a fibrin feloldásában mint a fibrin prekurzorának eliminációjában. Az azonos katalitikus, de eltérő számú kringle doménnel rendelkező proteázoknál a kcat/KM arány csökken a kringle domének elvesztésekor. Különösen feltűnő a fibrinoldásban meghatározott katalitikus állandó 6-szoros különbsége mini- és mikroplazmin között, amikor az 5. kringle is eltávolításra kerül. Ez a tény alátámasztja az 5. kringle szerepét a katalitikus domén funkcionális konformációjának fenntartásában, ahogy az a fibrin felszíni emésztésében mért kinetikai paraméterek [II] kapcsán már felvetődött. A katalitikus hatékonyság-csökkenés hátterében még az előző fejezetben tárgyalt processzivitás is állhat: a kringle domének elvesztésével a plazmin származékok már nem hidalhatják át a szomszédos monomerek közötti távolságot, és így csak disszociáció-diffúzió-asszociáció útján juthatnak el új hasítandó peptidkötésekhez. Rekombináns plazmin származékokkal vizsgált fibrinoldás során [132] olyan különbségek jelentkeznek a mini- és mikroplazmin között,
amelyek teljes összhangban állnak az általunk meghatározott kinetikai paraméterek alapján becsült katalitikus hatékonysággal.
4.3. PMN-elasztáz in vivo hatásának következményei a vérplazma fibrinolitikus