Munkám során több környezeti minta és vegyület genotoxikológiai és citotoxikológiai hatásait vizsgáltam meg, melyhez az SOS-ChromoTest-et és egy eredendően mikroszkópos spermium alapú toxicitási tesztet használtam, melyet flow citométerre adaptáltam.
A vizsgált minták közt komplex környezeti minták (szennyvizek, üledékek, aeroszolok) valamint különböző vegyületek (triklozán, biodízel) szerepeltek. A minták több esetben mutattak genotoxikus és/vagy citotoxikus hatásokat.
Az SOS-ChromoTest-tel vizsgált minták többsége a szakirodalmi adatokkal összhangban nem mutatott genotoxicitást, egyedül a dízel üzemű járművekből származó aeroszolok extraktumai esetén tudtam genotoxikus hatásokat detektálni. Habár egyes esetekben más módszerekkel cito- és/vagy genotoxikus hatásokat mutattunk ki, a tesztek érzékenysége változó lehet, így nem meglepő, ha esetenként eltérő eredményeket szolgáltatnak. Ugyan az ökotoxikológiai tesztek eredményei jelezhetik a cito- és genotoxikus hatások jelenlétét, azonban ezek sok esetben nem adnak pontos és átfogó képet a tényleges biológiai hatásokról. A különböző tesztanyagok toxicitásának vizsgálata során a prokarióta szervezetekkel kapott eredményeket nehéz extrapolálni magasabbrendű szervezetekre, ezért ilyen esetekben eukarióta sejtek használata reprezentatívabb lehet.
Az előbb felvázolt megfontolásból, valamint a teszt egyszerűségét, gyorsaságát, és a tesztprotokollokra vonatkozóan az EU által elvárt kritériumoknak való megfeleltethetőséget is figyelembe véve végeztem erőfeszítéseket arra vonatkozóan, hogy a spermium alapú toxicitási teszt módszerét flow citométerre ültessem át.
A sertés kansperma teszt flow citométerre adaptálásával jelentős lépést tettem a módszer automatizálhatósága felé. A hagyományos mikroszkópos technikákhoz képest sokkal gyorsabban és nagyságrendekkel több sejtet vizsgálva végezhető a teszt.
Mintánként 20000 eseményt vizsgálva az elméleti szórás 141, 0,7% CV mellett, miközben a mikroszkópos sejtszámlálás során jellemzően leszámolt 100-200 sejt esetében a szórás 10 - 14 és a CV = 10% – 7%, ami alátámasztja a módszer kiváló precizitását (Shapiro 2003).
A mikroszkópos sertés kansperma teszttel korábban már több citotoxicitást jelző sejtparaméter vizsgálatát végezték (pl.: mitokondriális aktivitás, plazmamembrán
98
integritás, élő/elpusztult sejtek aránya), azonban genotoxikológiai szempontból eddig még nem vizsgálták a spermiumok DNS károsodásait. A DNS fragmentálódás (és a defektes kromatinkondenzáció) vizsgálatára alkalmas Nicoletti tesztet és az oxidatív károsodásokat jelző 8-oxoguanin detektálására képes OxyDNA tesztet állítottam be és alkalmaztam sikeresen több minta esetén.
A kansperma teszt legtöbb esetben érzékenyen reagált a különböző citotoxikológiai paraméterek megváltozására. A vizsgált paraméterek közül az élő/elpusztult arány, a plazmamembrán- és a mitokondriális aktivitás változása rendelkeznek a leggyorsabban és legegyszerűbben kivitelezhető teszt protokollal és ezek jelezték a legérzékenyebben a vizsgált minták toxikus voltát.
A Nicoletti és az OxyDNA tesztek kivitelezése valamivel több időt és előkészületet igényel, illetve a vizsgált minták jóval kisebb mértékben mutattak genotoxikus hatásokat, mint citotoxikusakat. Ez egy részről megnyugtató, hogy a vizsgált minták közt viszonylag kevés mutat genotoxicitást, más részről azonban előfordult olyan eset is, amikor ugyanannak a mintának a vizsgálata más módszerekkel genotoxikus hatásokat mutatott.
Mint azt korábban már kifejtettem, az egyes genotoxicitás mérésére alkalmas módszerek működési elve és az alkalmazott tesztsejtek érzékenysége sok esetben jelentősen eltér, sőt nem is feltétlenül ugyanannak a paraméternek a változásait mérik. A spermiumok genotoxikológiai vizsgálatokra némi óvatossággal alkalmazhatók, ugyanis a spermiumok speciálisan kompakt kromatinszerveződését szem előtt kell tartanunk. Ez befolyásolhatja a DNS szál ellenálló képességét és a genotoxinok DNS szálhoz való hozzáférhetőségét, ezáltal elképzelhető, hogy az ilyen jellegű vizsgálatok érzékenysége alul maradhat más sejttípusok érzékenységével szemben.
A kansperma tesztet alkalmazva igazolni tudtam a triklozán citotoxikus hatásait és a mitokondriumok aktivitásának csökkenése-, a plazmamembrán integritás-, és az élősejt arány tekintetében dózis-válasz görbét tudtam felállítani. A biodízel spermiumokra gyakorolt hatása csekélynek bizonyult; csupán az élő sejtek arányának enyhe csökkenését váltotta ki egy nap expozíciót követően, azonban más tesztek érzékenyebben reagáltak ezáltal öko- és genotoxikus hatásokat mutattunk ki. A vizsgált gyógyszeripari szennyvíz minták hatására a spermiumokban a mitokondriumok károsodása és oxidatív DNS károsodások kialakulása volt kimutatható. A dízel aeroszolok extraktumainak hatására enyhe mértékű, azonban esetenként szignifikáns cito- és genotoxikus károsodások kialakulása volt jellemző a spermium sejtekben.
99
Úgy gondolom, hogy a flow citométerre átültetett kansperma teszt gyakorlati használhatóságát az előzőekben leírt kísérletek és a kapott eredmények bizonyítják. Én csupán néhány vizsgálható paraméterre dolgoztam ki és teszteltem mérési protokollokat, azonban a kansperma teszttel lényegében a legtöbb flow citométerrel vizsgálható spermium paraméter vizsgálható, így bizonyos minta típusok esetén, a spermiumok megfelelő érzékenységének köszönhetően kiválóan alkalmas lehet más toxikus hatások gyors detektálására, akár kinetikus módon is. Az általam beállított protokollok mellett lehetőség van más spermium paraméterek vizsgálatára is, hiszen rendelkezésre állnak olyan festési eljárások, melyekkel detektálni tudjuk a kalcium beáramlást, az akroszóma kapacitációját, a reaktív oxigénformák mennyiségét vagy más paraméterek változásait.
Habár erre vonatkozóan nem végeztem vizsgálatokat, de a teszt elméletileg alkalmas lehet nem csupán vizes oldatok és extraktumok, hanem akár direkt kontakt módon szuszpenziók vizsgálatára is.
Az általam flow citométerre adaptált spermium alapú toxicitási teszt az itt bemutatott vizsgálatokon felül számos lehetőséget tartogat magában, az eddig leírtakat figyelembe véve a teszt gyorsasága és egyszerűsége miatt alkalmas lehet akár környezeti monitoring céljaira is. Kedvező tulajdonságainak köszönhetően széles körben alkalmazhatónak, precíznek és könnyen reprodukálhatónak tűnik, melyekre alapozva további kutatásokat lehet építeni.
100
Tézispontok
1. Az SOS-ChromoTest™-tel vizsgált minták közül a dízel üzemű járművek kipufogógázaiból származó aeroszol minták közt találtam genotoxikus hatásúakat. Két személyautó kipufogógázaiból gyűjtött aeroszol minta esetében mutattam ki genotoxikus potenciált, továbbá a buszok kipufogógázaiból származó aeroszol minták közül metabolikus aktiválás nélkül négy mutatott genotoxicitást a legtöményebb koncentrációban. A vizsgált minták genotoxicitása egyértelmű összefüggést mutatott az ökotoxikológiai vizsgálat eredményeivel, illetve az autóbuszok esetén kapott toxicitás eredmények jó korrelációt mutattak a járművek környezetvédelmi besorolásával.
2. A sertés kanspermán alapuló teszt módszert sikeresen ültettem át flow citométerre és több teszt protokollt és festési eljárást is adaptáltam, melyekkel a spermiumok különböző sejtparaméterei akár egyidejűleg is vizsgálhatóak. A sertés kansperma teszttel a spermiumok DNS károsodását genotoxikológiai szempontból bioindikátorként használva eddig még nem vizsgálta senki, továbbá az említett módszereket áramlási citométerre sem alkalmazták. Az adaptált eljárások között találhatóak citotoxicitás vizsgálatára alkalmas paraméterek (mitokondriális aktivitás, plazma membrán integritás, élősejt arány), valamint genotoxicitás vizsgálatára alkalmas eljárások is (DNS-száltörések és oxidatív DNS károsodások detektálása), melyeket eddig még nem alkalmaztak a kansperma teszt során.
3. A flow citométerre adaptált kansperma toxicitási teszttel több esetben sikerült genotoxikus és citotoxikus hatásokat detektálni, több vizsgált mintatípus esetén. A kansperma tesztet alkalmazva igazolni tudtam a triklozán citotoxikus hatásait és a mitokondriumok aktivitásának csökkenése-, a plazmamembrán integritás-, és az élősejt arány tekintetében dózis-válasz görbét tudtam felállítani.
4. A biodízel vízoldható frakciójából az alkalmazott tesztrendszerrel egyértelműen citotoxikus és genotoxikus hatásokat mutattam ki. Leginkább a vízi tesztszervezetek reagáltak a legérzékenyebben, de egy nap expozíciót követően a kansperma teszttel is gyenge citotoxikus hatásokat detektáltam: az élő sejtek arányának enyhe csökkenését váltotta ki.
101
5. A vizsgált gyógyszeripari szennyvíz minták hatására a spermiumokban a mitokondriumok károsodása és oxidatív DNS károsodások kialakulása volt kimutatható. A kansperma teszt érzékenyebbnek bizonyult a kagyló hemolimfán végzett mikronukleusz tesztnél, amely egyik esetben sem mutatott genotoxicitást.
6. A dízel aeroszolok extraktumainak hatására enyhe mértékű, azonban esetenként szignifikáns cito- és genotoxikus károsodások kialakulása volt jellemző a spermium sejtekben. A kezelés hatására csökkent az élő sejtek száma és hiperpolarizálódtak a mitokondriumok, valamint a kontrollhoz viszonyítva jelentős oxidatív károsodás volt tapasztalható.
7. A kansperma teszt érzékenyebbnek bizonyult citotoxikológiai paraméterek vizsgálatára, mint a genotoxikológiai paraméterek vizsgálatára, melynek oka lehet, hogy a Nicoletti teszttel a DNS károsodásának csupán egy késői stádiuma detektálható, illetve a spermiumok speciális kromatinszerveződése miatt az érzékenysége más sejttípusokkal szemben alul maradhat.
8. A módszer egyértelműen alkalmas toxikológiai vizsgálatokra, (a megfelelő eszközök megléte mellett) olcsó, gyors és precíz, valamint könnyen reprodukálható és lehetőséget biztosít az automatizálásra. A módszer megfelel az EU által elvárt toxikológiai tesztekre vonatkozó kritériumoknak és irányelveknek. A teszttel a legtöbb flow citométerrel vizsgálható spermium paraméter vizsgálható, akár kinetikus módban is, valamint alkalmas lehet nem csupán vizes oldatok és extraktumok, hanem akár direkt kontakt módon szuszpenziók vizsgálatára is. A teszt gyakorlati használhatósága és a fent említett paraméterek miatt alkalmas lehet akár környezeti monitoring célokra is.
102
Theses
1. Amongst the samples tested with SOS-ChromoTest™, there were samples with genotoxic potential amongst the aerosol samples of exhaust gases from diesel car and bus samples. I have detected genotoxic potential in two aerosol samples from the exhaust gases of cars, and four of the aerosol samples from the exhaust gases of buses showed genotoxicity at the most concentrated concentration without metabolic activation. The genotoxicity of the tested samples showed a clear correlation with the results of the ecotoxicological study, and the toxicity results of the buses showed a good correlation with the environmental classification of the vehicles.
2. The test method based on boar spermatozoa was successfully transferred to a flow cytometry and several test protocols and staining procedures were adapted to test different cell parameters of the sperm at the same time. The DNA damage of spermatozoa as a genotoxic bioindicator has not yet been investigated by anyone with the boar sperm test, nor have these methods been applied to flow cytometry. The adapted methods include cytotoxicity assays (mitochondrial activity, plasma membrane integrity, live cell ratio), as well as genotoxicity assays (detection of DNA strand breaks and oxidative DNA damage), which have not yet been used in the boar sperm test.
3. Genotoxic and cytotoxic effects have been detected in several measured sample types with the boar sperm test adopted to flow cytometry. Applying the boar sperm test, I was able to demonstrate the cytotoxic effects of triclosan and determine the dose-response curve for the reduction of mitochondrial activity, plasma membrane integrity, and live cell ratio.
4. Cytotoxic and genotoxic effects were clearly demonstrated by the test system used in the water-soluble fraction of biodiesel. Mostly, aquatic organisms reacted the most sensitively, but after one day exposure, boar sperm test were also detected small cytotoxic effects: it caused a slight decrease in the proportion of living cells.
5. The investigated pharmaceutical wastewater samples caused mitochondria lesions and oxidative DNA damage in the spermatozoa cells. The boar sperm test was more sensitive than the micronucleus assay on shellfish hemolymph, which did not show genotoxicity in any case.
103
6. Diesel aerosol extracts showed mild but occasionally significant cytotoxic and genotoxic lesions in sperm cells. The number of living cells reduced, the mitochondria hyperpolarized, and significant oxidative DNA damage were detected compared to control.
7. The boar sperm test was more sensitive to cytotoxic parameters than genotoxicological parameters, which may be due to the fact that the Nicoletti test can only detect a late stage of DNA damage, and due to the special chromatin organization of spermatozoa cells, its sensitivity may remain below compared to other cell types.
8. The method is clearly suitable for toxicological studies, and (with the appropriate tools) it is cheap, fast, precise and easy to reproduce while it provides the opportunity for automation. The method meets the criteria and guidelines for toxicological tests required by the EU. The test can be used to test most sperm parameters that can be tested with flow cytometers, even in kinetic mode, and may be suitable for testing not only aqueous solutions and extracts, but also direct suspensions. Because of the practical usability of the test and the parameters mentioned above, it may be suitable for environmental monitoring purposes.
104
Irodalomjegyzék
Aammi, S., Karaca, F., & Petek, M. (2017). A toxicological and genotoxicological indexing study of ambient aerosols (PM2.5-10) using in vitro bioassays.
Chemosphere, 174, 490–498. doi:10.1016/j.chemosphere.2017.01.141
Agarwal, A., & Said, T. M. (2003). Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update, 9(4), 331–345.
doi:10.1093/humupd/dmg027
Ageno, M., Dore, E., & Frontali, C. (1969). The alkaline denaturation of DNA.
Biophysical journal, 9(11), 1281–311. doi:10.1016/S0006-3495(69)86452-0
Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Gibb, Z., & Baker, M. A. (2012). The simmet lecture: New horizons on an old landscape - oxidative stress, DNA damage and apoptosis in the male germ line. Reproduction in Domestic Animals, 47(SUPPL.4), 7–14.
doi:10.1111/j.1439-0531.2012.02049.x
Ajao, C., Andersson, M. A., Teplova, V. V., Nagy, S., Gahmberg, C. G., Andersson, L. C., et al. (2015). Mitochondrial toxicity of triclosan on mammalian cells. Toxicology Reports, 2, 624–637. doi:10.1016/j.toxrep.2015.03.012
Andersson, M. A., Jaaskelainen, E. L., Shaheen, R., Pirhonen, T., Wijnands, L. M., &
Salkinoja-Salonen, M. S. (2004). Sperm bioassay for rapid detection of cereulide-producing Bacillus cereus in food and related environments. International Journal of Food Microbiology, 94(2), 175–183. doi:DOI 10.1016/j.ijfoodmicro.2004.01.018
Andersson, M. A., Mikkola, R., Helin, J., Andersson, M. C., & Salkinoja-Salonen, M.
(1998). A novel sensitive bioassay for detection of Bacillus cereus emetic toxin and related depsipeptide ionophores. Applied and Environmental Microbiology, 64(4), 1338–1343. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9546170. Accessed 16 January 2017
Andersson, M. A., Mikkola, R., Rasimus, S., Hoornstra, D., Salin, P., Rahkila, R., et al.
(2010). Boar spermatozoa as a biosensor for detecting toxic substances in indoor dust and aerosols. Toxicology in Vitro, 24(7), 2041–2052. doi:10.1016/j.tiv.2010.08.011 Andersson, M. A., Nikulin, M., Köljalg, U., Andersson, M. C., Rainey, F., Reijula, K., et
al. (1997). Bacteria, molds, and toxins in water-damaged building materials. Applied and Environmental Microbiology, 63(2), 387–393. doi:10.1128/AEM.00588-06 Anonímusz 2017-12-16. (n.d.). A Reach Rendelet Értelmében Alkalmazandó Toxicitási
Tesztek. http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/toxicitásreachHU.pdf.
Accessed 16 December 2017
Bakonyi, G., Juhász, L., Kiss, I., & Palotás, G. (2003). Állattan. Mezőgazda Kiadó.
http://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tamop425/2011_0001_521_Allattan
Barbolt, T. A. (2002). Chemistry and Safety of Triclosan, and Its Use as an Antimicrobial Coating on Coated VICRYL* Plus Antibacterial Suture (Coated Polyglactin 910
105
Suture with Triclosan). Surgical Infections, 3(s1), s45–s53.
doi:10.1089/sur.2002.3.s1-45
Bavister, B. D., & Andrews, J. C. (1988). A rapid sperm motility bioassay procedure for quality-control testing of water and culture media. Journal of In Vitro Fertilization and Embryo Transfer, 5(2), 67–75. doi:10.1007/BF01130661
Bedoux, G., Roig, B., Thomas, O., Dupont, V., & Le Bot, B. (2012). Occurrence and toxicity of antimicrobial triclosan and by-products in the environment. Environmental Science and Pollution Research, 19(4), 1044–1065. doi:10.1007/s11356-011-0632-z Bencsik, O., Papp, T., Berta, M., Zana, A., Forgó, P., Dombi, G., et al. (2014). Ophiobolin
A from Bipolaris oryzae perturbs motility and membrane integrities of porcine sperm and induces cell death on mammalian somatic cell lines. Toxins, 6(9), 2857–2871.
doi:10.3390/toxins6092857
Bernstein, C., R., A., Nfonsam, V., & Bernstei, H. (2013). DNA Damage, DNA Repair and Cancer. In New Research Directions in DNA Repair. InTech. doi:10.5772/53919 Berridge, M. J. (2014). Module 8: Development. Cell Signalling Biology, 6, csb0001008.
doi:10.1042/csb0001008
Besis, A., Tsolakidou, A., Balla, D., Samara, C., Voutsa, D., Pantazaki, A., et al. (2017).
Toxic organic substances and marker compounds in size-segregated urban particulate matter - Implications for involvement in the in vitro bioactivity of the extractable organic matter. Environmental Pollution, 230, 758–774.
doi:10.1016/j.envpol.2017.06.096
Bierkens, J., Brits, E., & Verschaeve, L. (2009). Environmental Monitoring for Genotoxic Compounds. In Environmental Toxicity Testing (pp. 229–256).
doi:10.1002/9781444305531.ch8
Bluhm, K., Heger, S., Seiler, T.-B., Hallare, A. V., Schäffer, A., & Hollert, H. (2012).
Toxicological and ecotoxicological potencies of biofuels used for the transport sector—a literature review. Energy & Environmental Science, 5(6), 7381.
doi:10.1039/c2ee03033k
Bocchi, C., Bazzini, C., Fontana, F., Pinto, G., Martino, A., & Cassoni, F. (2016).
Characterization of urban aerosol: seasonal variation of mutagenicity and genotoxicity of PM2.5, PM1 and semi-volatile organic compounds. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 809, 16–23.
doi:10.1016/j.mrgentox.2016.07.007
Boller, K., & Schmid, W. (1970). [Chemical mutagenesis in mammals. The Chinese hamster bone marrow as an in vivo test system. Hematological findings after treatment with trenimon]. Humangenetik, 11(1), 35–54.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5490354. Accessed 18 December 2017 Bombardier, M., Bermingham, N., Legault, R., & Fouquet, A. (2001). Evaluation of an
SOS-Chromotest-based approach for the isolation and detection of sediment-associated genotoxins. Chemosphere, 42(8), 931–944. doi:10.1016/S0045-6535(00)00151-X
106
Bratek, Z., Fodor, F., Király, I., Nyitrai, P., Parádi, I., Rácz, I., et al. (2013). A nukleinsav-anyagcsere speciális növényi vonatkozásai. In F. Fodor (Ed.), A növényi nukleinsav-anyagcsere élettana. Budapest: ELTE TTK.
http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/ANovenyiAnyagcsere/index.html Chen, G., & White, P. A. (2004). The mutagenic hazards of aquatic sediments : a review,
567, 151–225. doi:10.1016/j.mrrev.2004.08.005
Claassens, O. E., Wehr, J. B., & Harrison, K. L. (2000). Optimizing sensitivity of the human sperm motility assay for embryo toxicity testing. Human reproduction
(Oxford, England), 15(7), 1586–91. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10875871
Clancy, S. (2008). DNA Damage & Repair: Mechanisms for Maintaining DNA Integrity.
Nature Education, 1(1), 3–5. doi:10.1038/nrm2351.pdf
Clare, G. (2012). The in vitro mammalian chromosome aberration test. In Methods in Molecular Biology (Vol. 817, pp. 69–91). doi:10.1007/978-1-61779-421-6_5
Claxton, L. D., Houk, V. S., & Hughes, T. J. (1998). Genotoxicity of industrial wastes and effluents. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. doi:10.1016/S1383-5742(98)00008-8
Collins, A. R. (2004). The Comet Assay for DNA Damage and Repair: Principles, Applications, and Limitations. Molecular Biotechnology, 26(3), 249–261.
doi:10.1385/MB:26:3:249
Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., & Lunec, J. (2003). Oxidative DNA damage:
mechanisms, mutation, and disease. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 17(10), 1195–214.
doi:10.1096/fj.02-0752rev
Cooney, D. J., & Hickey, A. J. (2011). Cellular response to the deposition of diesel exhaust particle aerosols onto human lung cells grown at the air-liquid interface by inertial impaction. Toxicology in Vitro, 25(8), 1953–1965. doi:10.1016/j.tiv.2011.06.019 Cox, J. A., Fellows, M. D., Hashizume, T., & White, P. A. (2016). The utility of metabolic
activation mixtures containing human hepatic post-mitochondrial supernatant (S9) for in vitro genetic toxicity assessment. Mutagenesis, 31(2), 117–130.
doi:10.1093/mutage/gev082
Coz, A., Rodríguez-Obeso, O., Alonso-Santurde, R., Álvarez-Guerra, M., Andrés, A., Viguri, J. R., et al. (2008). Toxicity bioassays in core sediments from the Bay of Santander, northern Spain. Environmental Research, 106(3), 304–312.
doi:10.1016/j.envres.2007.05.009
Čupr, P., Flegrová, Z., Franců, J., Landlová, L., & Klánová, J. (2013). Mineralogical, chemical and toxicological characterization of urban air particles. Environment International, 54, 26–34. doi:10.1016/j.envint.2012.12.012
Darzynkiewicz, Z., Galkowski, D., & Zhao, H. (2008). Analysis of apoptosis by cytometry using TUNEL assay. Methods, 44(3), 250–254. doi:10.1016/j.ymeth.2007.11.008
107
Dayan, A. D. (2007). Risk assessment of triclosan [Irgasan®] in human breast milk. Food and Chemical Toxicology, 45(1), 125–129. doi:10.1016/j.fct.2006.08.009
De Jonge, C. J., Centola, G. M., Reed, M. L., Shabanowitz, R. B., Simon, S. D., & Quinn, P. (2003). Human sperm survival assay as a bioassay for the assisted reproductive technologies laboratory. Journal of andrology, 24(1), 16.
http://www.andrologyjournal.org/cgi/content/full/24/1/16 Deák, V. (2014). Általános Genetika. Budapest: Typotex Kiadó.
http://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tamop412A/2011_0079_deak_alt_genetika/ch 08s03.html
Degrendele, C., Okonski, K., Melymuk, L., Landlova´, L., Kukucˇka, P., Cˇupr, P., &
Kla´nova´, J. (2014). Size specific distribution of the atmospheric particulate
PCDD/Fs, dl-PCBs and PAHs on a seasonal scale: Implications for cancer risks from inhalation. Atmospheric Environment, 98, 410–416.
doi:10.1016/j.atmosenv.2014.09.001
DeMarini, D. M., Brooks, L. R., Warren, S. H., Kobayashi, T., Gilmour, M. I., & Singh, P.
(2004). Bioassay-directed fractionation and Salmonella mutagenicity of automobile and forklift diesel exhaust particles. Environmental Health Perspectives, 112(8), 814–
819. doi:10.1289/ehp.6578
Demirovic, D., & Rattan, S. I. S. (2013). Establishing cellular stress response profiles as biomarkers of homeodynamics, health and hormesis. Experimental Gerontology, 48(1), 94–98. doi:10.1016/j.exger.2012.02.005
Dhillon, G. S., Kaur, S., Pulicharla, R., Brar, S. K., Cledón, M., Verma, M., & Surampalli, R. Y. (2015). Triclosan: Current status, occurrence, environmental risks and
bioaccumulation potential. International Journal of Environmental Research and Public Health, 12(5), 5657–5684. doi:10.3390/ijerph120505657
Eck-Varanka, B., Kováts, N., Horváth, E., Ferincz, Á., Kakasi, B., Nagy, S. T., et al.
(2018). Eco- and genotoxicity profiling of a rapeseed biodiesel using a battery of bioassays. Ecotoxicology and environmental safety, 151, 170–177.
doi:10.1016/j.ecoenv.2018.01.015
Ekwall, B., Silano, V., & Zucco, F. (1990). Chapter 7 - Toxicity Tests with Mammalian Cell Cultures. Short-term Toxicity Tests for Non-genotoxic Effects, 75–98.
doi:10.1155/2014/180549
Emery, D. (2012). Assessing the Genotoxicity of triclosan in Tadpoles of the American
Emery, D. (2012). Assessing the Genotoxicity of triclosan in Tadpoles of the American