K ÜLÖNBÖZŐ NULLA VEGYÉRTÉKŰ VAS NANORÉSZECSKÉK HATÁSA A MIKROBIÁLIS

5.2.1.1. Anaerob heterotróf élő sejtszám

Anaerob heterotróf lemez értékeléssel (R2A agar, 25 °C, 48 óra inkubáció, anaerob környezet) meghatároztuk a tenyészthető heterotróf sejtek számát. Az 5.11. ábra mutatja a baktériumok szaporodásának dinamikáját. A vártnak megfelelően a biotikus kontroll mintában a sejtszám közel állandó volt (ún. stacioner szakasz). A vas nanorészecskék adagolásának (az ábrán nyíllal jelölve) hatására kezdetben mindegyik mikrokozmoszban

lecsökkent az élő, tenyészhető sejtek száma, majd ezt követően sejtszám növekedést figyeltünk meg.

5.11. ábra. Az anaerob tenyészthető sejtek számának változása 0,1 g/L-es koncentrációban adagolt különböző típusú nanovas hatására.

A nyíl a nanovas adagolás időpontját jelöli.

A nátrium-borohidriddel redukált vas minták esetében a baktériumok hamarabb elérték a stacioner szakaszt, az élő csíraszám a 10. naptól kezdve állandósult a kontroll mintához képest egy alacsonyabb értéken. Ezzel szemben a nátrium-ditionittal redukált nanovasas kezelés hatására a kezdeti sejtszám csökkenés után sejtszám növekedést figyeltünk meg, amely a 20. nap körül már elérte a kontroll minta sejtszámának értékét.

Megállapíthatjuk tehát, hogy a nanovasas kezelés kezdetben drasztikus sejtszám csökkenést eredményez, majd az új környezethez alkalmazkodás (adaptálódás) után mindkét típusú nanovas adagolása esetén megindul a túlélő baktériumok sejtszámának növekedése – bár a nátrium-borohidrides mintáknál kisebb mértékben –, ami egy idő után beáll egy konstans értékre.

Megjegyzendő, hogy ez a módszer nem alkalmazható a nem tenyészthető baktériumok kimutatására, így a biodegradációban résztvevő Dehalococcoides, metanogén vagy szulfátredukáló baktériumok számának meghatározására, ezért ezen közösségek arányának változását génspecifikus kvantitatív PCR-rel követtük nyomon (lásd később 5.2.1.4. fejezet) a kísérlet során.

5.2.1.2. Biomassza mennyiség

A DNS koncentráció információt ad a mikrokozmoszban lévő összes biomassza mennyiségéről, így a tenyészthető és nem tenyészthető baktériumok mennyiségéről is. Az 5.12. ábra mutatja a különböző típusú nanovas adagolás mellett megfigyelt összes DNS koncentráció változásokat a mikrokozmosz rendszerekben.

5.12. ábra A mikrokozmosz rendszerek DNS koncentrációjának változása a különböző típusú nanovas adagolás hatására

Az adagolás nélküli biotikus kontroll esetében az idő előrehaladtával a vártnak megfelelően, nem tapasztaltunk változást a kiindulási DNS koncentrációhoz képest illetve a tenyészthető baktériumok számában.

Az első mintavételnél, tehát 4 nappal a nulla vegyértékű vas nanorészecskék adagolása után, mikrobiális biomassza csökkenést figyeltünk meg mindegyik kezelt minta esetében. Ez a csökkenés valószínűleg a vas nanorészecskék toxikus hatásának köszönhető, ahogy azt már korábban mások is bemutatták⁹³. A 10. mintavételi naptól a biomassza mennyiségének a növekedése volt jellemző mind a négy kezelt mintában. A 20. mintavételi napon pedig jól látható, hogy mindegyik kezelt minta túlnőtte a biotikus kontrollt. Érdekes módon a nátrium-ditionittal redukált vas nanorészecskék alkalmazása esetében figyeltük meg a legnagyobb DNS koncentráció növekedést, a nátrium-borohidriddel redukált vas részecskék adagolása kisebb mértékű biomassza növekedést eredményezett. Xiu és munkatársai hasonló tendenciát figyeltek meg a kísérleteik során: a nanovas adagolás kezdetben gátolta a

baktériumok növekedését, de a kezdeti toxikus hatás után a környezethez adaptálódott mikroflóra alakult ki, majd növekedésnek indult⁹³.

5.2.1.3. Eubaktérium összetétel (DGGE vizsgálatok)

A DGGE módszerrel nyomon követhető a bakteriális közösség diverzitás változása a különböző adalékanyagok hatására. A nested PCR során a 16S rDNS (16S riboszómális RNS-t kódoló gén) variábilis V3 régióját amplifikáltuk eubakteriális primerek segítségével. A vizsgálattal arról próbáltunk információt kapni, hogy milyen a nem kezelt, kontroll mikrokozmosz közösség komplexitása, valamint arról, hogy ez miként módosult a különböző vas nanorészecskés kezelés hatására. A 20. napi, 40-60%-os denaturáló koncentrációjú DGGE gélről készült felvételen (5.13. ábra) látható, hogy a megfigyelt csíkok (band-ek) száma nagyon hasonló volt mindegyik sávban (line). Kis eltéréseket figyeltünk meg a csíkok intenzitásában a vas nanorészecskék szintézise során alkalmazott redukálószer függvényében, tehát a kezelés után kis mértékben megváltozott a bakteriális közösség diverzitása. A nátrium-borohidriddel redukált vas nanorészecskék (nZVICl3B

és nZVISB) adagolása esetén a minták DGGE profilján látható csíkok intenzitása és száma hasonló eloszlást mutatott a kontroll mintában megfigyeltekével. A nátrium-ditionittal előállított vas nanorészecskékkel történő kezelés hatására több csík kierősödését észleletük, amiből néhány eddig alulreprezentált törzs előtérbe kerülésére következtethetünk.

5.13. ábra. A biotikus kontroll és a különböző nanovassal kezelt rendszerek DGGE elemzésének eredménye a 20. napon

5.2.1.4. A biodegradációban részt vevő baktériumok relatív mennyiségének változása

Ahogy azt 5.2.1.2 fejezetben bemutattuk, a kísérlet során a minták összes baktérium mennyisége kezdetbencsökkent, majd nőtt a kezelés hatására függetlenül attól, hogy melyik nanovasat alkalmaztuk.

A biodegradációban fontos szerepet játszó Dehalococcoides törzsek, szulfátredukáló és metanogén baktériumok relatív mennyiségének változását is szerettük volna vizsgálni a különböző vas nanorészecskék adagolásának hatására. A változás meghatározása kvantitatív PCR (qPCR) segítségével történt, az egyes génekre meghatározott értékeket a teljes eubaktérium mennyiséghez viszonyítottuk. A specifikus PCR reakciók során vizsgáltuk a dhc, vcrA, tceA, dsrA, apsA és mcrA gének mennyiségének alakulását a mikrokozmosz rendszerekben. Az eredményeket az 5.3. táblázat foglalja össze.

Jól látható, hogy a különböző baktérium nemzetségeket és enzimeket kódoló gének relatív mennyiségének változása erősen függ a vas nanorészecskék szintézise során alkalmazott redukálószertől. Kivétel ez alól a Dehalococcoides törzsek arányának változása.

Ebben az esetben azt tapasztaltuk, hogy függetlenül attól, hogy melyik vas nanorészecskét adagoltuk, a Dehalococcoides törzsek relatív aránya csökkent. Tehát a Dehalococcoides törzsek mennyiségének relatív változása független volt a vas nanorészecskék előállítási körülményeitől, azaz a szintézis során felhasznált kiindulási vas-sóktól és redukálószerektől.

Azonban a reduktív dehalogenáz génnel (tceA és vcrA) rendelkező Dehalococcoides törzsek mennyisége nem csökkent olyan mértékben, mint a teljes Dehalococcoides populáció, tehát mindegyik típusú vas nanorészecske kevésbé gátolta azokat a Dehalococcoides törzseket, amik a reduktív deklorinációért felelősek. A kezdeti toxikus hatás után kialakult átrendeződés után, a 20. napon megfigyelhető volt, hogy a reduktív dehalogenáz géneket tartalmazó Dehalococcoides törzsek mennyisége visszaállt a biotikus kontroll arányainak megfelelően.

A szulfátredukáló baktériumok mennyiségének változását a disszimilatórikus szulfit-reduktáz (dsrA) és adenozin-foszfoszulfát-reduktáz (apsA) gének, mint filogenetikai markerek alkalmazásával vizsgáltuk. A nátrium-borohidriddel előállított nanovassal történő kezelés esetén az ezeket a reduktáz géneket tartalmazó baktériumok populációjában csak kismértékű változás (kisebb növekedés, majd csökkenés) történt. Ugyanakkor a nátrium-ditionittal redukált vas nanorészecskék alkalmazása a szulfátredukáló baktériumok számának növekedését eredményezte, ami arra enged következtetni, hogy ezek a vas nanorészecskék segítik a szulfátredukálók életben maradását és növekedését.

A metil-koenzim-M reduktáz génnel (mcrA) rendelkező baktériumok populációjában mind a négy nanovas alkalmazásánál csökkenést figyeltünk meg a 20. nap végére, a csökkenés mértéke kissé nagyobb volt a nátrium-ditionitos minták esetében. Megjegyzendő, hogy a nZVISB

mintánál kezdetben nagymértékű növekedést, majd hirtelen lecsökkenést figyeltünk meg. Mivel a kísérletek során a nanovasak hozzáadását követően nem történt szubsztrát adagolás, így a metanogén baktériumok csökkenését a szubsztrát elfogyása is okozhatta.

5.3. táblázat. A biodegradációban résztvevő mikroorganizmusok és a reduktív dehalogenáz gének relatív arányának változása a különböző nanovas adagolás hatására

A vas nanorészecskék anaerob korroziója során keletkező hidrogéngáz (5.1.1.3, 5.1.1.4 és 5.1.1.5 fejezet) a biodegradáló mikroorganizmusok számára elektrondonorként

szolgálhat. Ha a kémiai nanovas általi lebontás és a mikrobiológiai deklorináció folyamata szinergikus, akkor a vas nanorészecskék képesek lebontani a szennyezők nagy részét, majd a vas által kialakult kedvező reduktív környezetben a maradék klórozott etilének lebontását a deklorináló baktériumok végzik.

Kapott eredményeink csak részben korrelálnak a szakirodalomban fellelhető adatokkal. Számos publikációban kimutatták, hogy a vas nanorészecskék elektrondonorként serkenthetik a metántermelődést és a szulfátredukálás folyamatát. További vizsgálatok szükségesek az általunk vizsgált vas nanorészecskék metanogenezist gátló folyamatának pontos megismeréséhez.