Immunszuppresszió és gyulladás-gátlás

4.4.2. Immunszuppresszió és gyulladás-gátlás

A mesenchymalis őssejtek egyik legmeglepőbb és terápiás szempontból legígéretesebb sajátsága az in vitro kultúrákban és in vivo kísérleti rendszerekben is megnyilvánuló erőteljes immunszuppresszív és gyulladásgátló aktivitása Gebler A et al, 2012.

4.4.2.1. A mitogén és alloantigén-indukált T-sejt proliferáció gátlása in vitro kultúrában Első kérdésünk tehát az volt, hogy az általunk különböző szervekből izolált MSC-k rendelkeznek-e a csontvelői társaikéhoz hasonló, az aktivált T-sejtek osztódását gátló aktivitással. Mint a 34. ábra mutatja, a lépből és a zsírszövetből izolált MSC-k - a fiatal és a felnőtt állatok csontvelőjéből származó őssejtekhez hasonlóan – maximum 70-80%-os

33. ábra. A galektin-1 hatása a csontvelői magvas sejtek és a vérképző elődsejtek kemotaxisára és transzendotheliális migrációjára. A csontvelői sejteket az üres (A, B), illetve endothel sejtekkel fedett (C, D) Millicell- betétekbe helyeztük Gal-1 nélkül, vagy növekvő koncentrációjú Gal-1 hozzáadása mellett. A tálca lyukainak inzert alatti részébe 100 ng/ml rekombináns egér SDF-1-et tettünk (A-D), majd 6 órával később meghatároztuk a membránon keresztül a lyukak alsó részébe átvándorolt csontvelői magvas (A, C) és GM-CSF sejtek (B, D) számát. A migrációs index kiszámításához az SDF-1 hatására migráló sejtek számát elosztottuk a spontán vándorló sejtek számával. Három kísérlet átlaga ± szórás.

34. ábra. A különböző szervekből izolált mesenchymalis őssejtek hatása a lép T lymphocyták mitogén (ConA) és alloantigén indukált proliferációjára. (A) 96 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiban az ábrán jelzett számú FCs-, Cs-, Zs-, Th-, Lp-, és Ao-MSC-ket 2x10⁵ lép T-sejttel együtt inkubáltunk 5 g/ml ConA jelenlétében. Két nap után 1 Ci ³ H-timidint adtunk a kultúrákhoz, majd további 8 óra elteltével learattuk a sejteket. (B) 96 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiban 2x10⁵ C57Bl/6 lépsejtet (responder sejtek) és 2x10⁵, besugárzott (30 Gy) Balb/c lépsejtet (stimulátor sejtek) inkubáltunk 10⁴, különböző eredetű MSC egyidejű jelenlétében. A tenyészeteket 4 nap elteltével jelöltük 1 Ci ³H-timidinnel és további 8 óra múlva arattuk le a sejteket. A beütésszámokat (cpm) folyadékszcintillátorban mértük. Három kísérlet átlaga ± szórás.

mértékben gátolják a lépsejtek mitogén (ConA) indukált proliferációját. Az Ao-MSC-k kisebb (40-50%-os), de ugyancsak szignifikáns gátló aktivitással rendelkeznek, míg a Th-MSC-k nem befolyásolják a lép T-sejtek osztódását. Hasonló eredményt kaptunk, amikor a lép T-sejtek alloantigénre adott válaszának gátlását vizsgáltuk C57Bl/6 (H-2b) responder és besugárzott Balb/c (H-2d) stimulátor lépsejtekből összeállított kevert lymphocyta kultúrákban (MLR) a különböző eredetű MSC-k egyidejű jelenlétében.

A szuppresszió mechanizmusát az MSC-kből felszabaduló – és az irodalmi adatok alapján szóba jöhető (Ben-Ami E et al, 2011) - különböző szolubilis mediátorok szintéziséért felelős enzimek aktivitásának gátlása alapján próbáltuk feltárni. ConA-val stimulált lép T-sejtekből és Cs-, vagy Zs-MSC-kből álló tenyészetekhez enzimgátlókat adtunk a lehető legmagasabb, sejtpusztulást még nem okozó koncentrációban.

Megállapítottuk, hogy a ciklooxigenáz enzimeket (COX-1, COX-2) gátló indometacin (Indo, 10 M), valamint a nitrogén-oxid-szintáz (NOS) gátló N-metil-L-arginin-acetát (L-NMA, 1 mM) részben képes feloldani mind a Cs-, mind a Zs-MSC-k T-sejt osztódást gátló hatását. Az Indo és L-NMA együttes alkalmazása esetén azonban a két enzimgátló hatása nem volt additív. Az indolamin-2,3-dioxigenáz enzim (IDO) működését gátló metil-triptofán (1-MT, 1 mM) adása egyáltalán nem befolyásolta az eredményeket (35.. ábra).

Mivel kevert lymphocyta kultúrában ugyanezt tapasztaltuk (36. ábra), elmondhatjuk, hogy a mitogén- és alloantigén-indukált T-sejt proliferáció MSC-k általi gátlásában a posztaglandin(ok)nak és NO-nak is szerepe van, míg az IDO enzim nem érintett a folyamatban. Ugyanakkor tény, hogy „trans-well” kultúrákban, amikor a T-sejtek és MSC-k félig áteresztő hártyával vannaMSC-k elválasztva egymástól, az őssejteMSC-k nem MSC-képeseMSC-k gátolni a T lymphocyták osztódását (nem mutatjuk). Ebből következik, hogy közvetlen sejt-sejt (MSC-aktivált T-sejt) kölcsönhatásra is szükség van a gátlás során.

4.4.2.2. A gyulladásos környezet szerepe a mesenchymalis őssejtek prosztaglandin E2 termelésének szabályozásában

Részben a fenti eredmények, részben irodalmi adatok alapján (Németh K et al, 2009; De Miguel MP et al, 2012) a továbbiakban a Cs- és Zs-MSC-k prosztaglandin E2 (PGE2) termelésének szabályozására koncentráltunk. Amikor ConA-aktivált lép T-sejtekkel együtt tenyésztettük az MSC-ket, akkor mind a csontvelői, mind a zsírszövet eredetű őssejtek PGE2 termelése megnőtt (~12-14x10³ pg/ml) a kontroll - csak Csv-, vagy csak Zs-MSC-ket tartalmazó - kultúrák felülúszóiban mérhető értékekhez (1857 ± 365, ill.

3897 ± 415 pg/ml) képest (37A, B ábra).

35. ábra. A mesenchymalis őssejteknek a mitogén-indukált T lymphocyta proliferációra gyakorolt gátló hatása COX és NOS enzim gátlókkal részben feloldható. 96 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiban - az ábrán feltüntetett kombinációkban - 2x10⁵ lép T-sejtet, 2x10⁴ csontvelői (A), illetve zsírszövet eredetű (B) MSC-t, 5 g/ml ConA-t, valamint különböző enzimgátlókat (Indo, 1-MT, és L-NMA) inkubáltunk. Két nap elteltével 1 Ci ³H-timidint adtunk a kultúrákhoz, majd további 8 óra múlva learattuk a sejteket. A beütésszámokat (cpm) folyadékszcintillátorban mértük. Három kísérlet átlaga ± szórás.

36. ábra. A mesenchymalis őssejteknek az alloantigén-indukált T lymphocyta proliferációra gyakorolt gátló hatása COX és NOS enzimgátlókkal részben feloldható. 96 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiban - az ábrán feltüntetett kombinációkban - 2x10⁵ C57Bl/6 lépsejtet (responder sejtek), 2x10⁵, besugárzott (30 Gy) Balb/c lépsejtet (stimulátor sejtek), 2x10⁴ csontvelői (A), illetve zsírszövet eredetű (B) MSC-t, valamint különböző enzimgátlókat (Indo, 1-MT, és L-NMA) inkubáltunk. A tenyészeteket 4 nap elteltével jelöltük 1 Ci ³H-timidinnel és további 8 óra múlva arattuk le a sejteket. A beütésszámokat (cpm) folyadékszcintillátorban mértük. Három kísérlet átlaga ± szórás.

37. ábra. Az aktivált T lymphocyták erőteljesen fokozzák a mesenchymalis őssejtek prosztaglandin E2 termelését. 24 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiban - az ábrán feltüntetett kombinációkban - 2x10⁶ lép T-sejtet, 2x10⁵ csontvelői (A), illetve zsírszövet eredetű (B) MSC-t, 5 g/ml ConA-t, valamint ConA aktivált T sejtek felülúszóját (T-sejt SN) inkubáltunk. Két nap után a tenyészetek felülúszóiban ELISA technikával meghatároztuk a PGE2 mennyiségét. Három kísérlet átlaga ± szórás. TW = „transwell” kultúra.

A nem aktivált T lymphocyták hatása hasonló, csak sokkal kisebb mértékű volt. Ha viszont fizikailag elválasztottuk egymástól a T-sejteket és az MSC-ket, vagy az intakt T lymphocyták helyett a ConA-aktivált T-sejtek felülúszóját adtuk az MSC kultúrákhoz, az őssejtek PGE2 szekréciója soha nem haladta meg a kontroll értékeket. Az aktivált T-sejt indukált PGE2 termelés Indo jelenlétében gyakorlatilag megszűnt, az L-NMA azonban – ebben a kísérleti rendszerben - nem befolyásolta a mediátor termelését (38. ábra).

Némiképp eltérő eredményeket kaptunk, amikor az MSC-ket gyulladáskeltő citokinekkel kezeltük. A TNF- magas (50 ng/ml) koncentrációban jelentős PGE2 szekréciót indukált az MSC tenyészetekben, de 10 ng/ml koncentrációban már hatástalannak bizonyult. Az IFN- viszont – önmagában - mindkét vizsgált koncentrációban (100 és 20 ng/ml) hatástalan volt. Ugyanakkor, ha a két citokint együtt alkalmaztuk, akkor alacsony koncentrációk (10 ng/ml TNF- és 20 ng/ml IFN-) esetén is igen jelentős PGE2 termelést mértünk mind a Cs-, mind a Zs-MSC kultúrák felülúszóiban (39. ábra). A két citokinnek az MSC-k PGE2 termelésére gyakorolt hatása tehát erősen szinergisztikus. Ráadásul, a TNF- és az IFN- egyidejű jelenlétében indukált PGE2 termelés az Indo mellett - legalábbis részlegesen (60-70%) – L-NMA-val is gátolható, míg a magas koncentrációjú (50 ng/ml) TNF-–val kiváltott PGE2 termelés nem (40. ábra). A NO, pontosabban a nitrit koncentrációja ugyanezekben az MSC felülúszókban legfeljebb 2-3-szorosára nőtt a kezeletlen kontrollhoz (8,1 ± 4,2 M) képest, függetlenül attól, hogy milyen citokin koncentrációt, illetve kombinációt alkalmaztunk (nem mutatjuk).

Feltételezzük tehát, hogy a NO-nak elsősorban az MSC-ken belüli jeltovábbításban lehet szerepe a PGE2 termelés szabályozása során.

4.4.2.3. A mesenchymalis őssejtek és a mononukleáris fagocitasejtek kölcsönhatása – a macrophagok polarizációjának változása az őssejtek jelenlétében

Az MSC-k PGE2 termelésének vizsgálata azért (is) fontos, mert – mint erre irodalmi adatok is utalnak (Németh K et al, 2009) - ez lehet az őssejtek és a mononukleáris fagocitasejtek közötti kölcsönhatás(ok) során felszabaduló egyik legfontosabb szolubilis mediátor. A laboratórimunkban az értekezés megírásakor folyó kísérletek még nem publikált eredményei arra utalnak, hogy az MSC-k képesek befolyásolni a szöveti macrophagok (MΦ) polarizációját. Mind a Csv-MSC-k, mind a Zs-MSC-k képesek fokozni például a peritoneális MΦ-ok fagocitáló képességét és egyidejűleg jelentősen megváltoztatni a fagocita sejtek által szekretált citokinek arányát a kultúra-felülúszókban.

Bár a TNF- abszolút mennyiségét általában nem befolyásolják, a gyulladásgátló hatású

38. ábra. A mesenchymalis őssejtek T-sejt indukált prosztaglandin E2 termelése indometacinnal gátolható. 24 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiban - az ábrán feltüntetett kombinációkban - 2x10⁶ lép T-sejtet, 2x10⁵ csontvelői (A), illetve zsírszövet eredetű (B) MSC-t, 5 g/ml ConA-t, valamint COX és NOS enzimgátlókat (Indo, ill. L-NMA) inkubáltunk. Két nap után a tenyészetek felülúszóiban ELISA technikával meghatároztuk a PGE2 mennyiségét. Három kísérlet átlaga ± szórás.

39. ábra. A mesenchymalis őssejtek gyulladásos citokinek jelenlétében is nagy mennyiségű prosztaglandin E2-t termelhetnek. 24 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiban - az ábrán feltüntetett kombinációkban - 2x10⁵ csontvelői (A), illetve zsírszövet eredetű (B) MSC-t inkubáltunk rekombináns TNF- és/vagy IFN- jelenlétében. Két nap után a tenyészetek felülúszóiban ELISA technikával meghatároztuk a PGE2 mennyiségét. Három kísérlet átlaga ± szórás.

40. ábra. A mesenchymalis őssejtek gyulladásos citokin-indukált prosztaglandin E2 termelésének gátlása. 24 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiban - az ábrán feltüntetett kombinációkban - 2x10⁵ csontvelői eredetű MSC-t, különböző mennyiségű TNF--t és/vagy IFN--t, valamint COX és NOS enzimgátlókat (Indo, ill. L-NMA) inkubáltunk.

Két nap után a tenyészetek felülúszóiban ELISA technikával meghatároztuk a PGE2 mennyiségét. Három kísérlet átlaga ± szórás.

41. ábra. A mesenchymalis őssejtek hatása a fagocitáló macrophagok citokin és prosztaglandin E2 termelésére. 24 lyukú tenyésztőtálcák lyukaiban - az ábrán feltüntetett kombinációkban – 2x10⁵ peritoneális MΦ-ot, élesztő sejteket, apoptotizáló thymocytákat és csontvelői eredetű MSC-ket inkubáltunk. Két nap után a tenyészetek felülúszóiban ELISA technikával mértük a TNF-, az IL-10 és a PGE2 koncentrációját. Három kísérlet átlaga ± szórás.

IL-10 szintjét – a felülúszók PGE2 koncentrációjának növekedésével többé-kevésbé párhuzamosan - erőteljesen fokozzák (41. ábra). Az LPS-el in vitro aktivált MΦ-ok M1 irányú polarizációját szintén gátolják a stroma sejtek. Ráadásul, olyan kísérleti elrendezésben, ahol MΦ-ok, MSC-k és in vivo aktivált, antigén-specifikus T-sejtek egyidejűleg vannak jelen, nő a regulátor T-sejtek és csökken a gyulladásos folyamatokban aktiváló szerepet játszó Th17 sejtek aránya (nem mutatjuk). Mindezek alapján MSC-k jelenlétében a MΦ-ok sokkal inkább gyulladásgátló (M2-es, pontosabban M2b vagy

„regulátor”), semmint „klasszikus” gyulladáskeltő (M1-es) fenotípust mutatnak. Az MSC - MΦ kölcsönhatásnak tehát meghatározó szerepe lehet az őssejtek in vivo megfigyelhető erőteljes immunszuppresszív és gyulladásgátló aktivitásában, valamint a sérült szövetek regenerációjában is.

4.4.3. Szövet-regeneráció és sejtterápia - a streptozotocin-indukált diabetes