I N VIVO FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATOK

IV.3.1. Képalkotó vizsgálatok

IV.3.1.1. Két-foton mikroszkópos mérések

A két-foton mikroszkópos mérésekhez a Femto 2D High Sensitivity Galvanoscanner-Based Two-Photon Microscope (Femtonics Kft., Budapest, Magyarország) konfokális, lézerpásztázó fluoreszcens rendszert használtuk. Pentobarbitál-nátrium anesztéziában (50 mg/ttkg; Nembutal, Abbott Laboratories, Budapest, Magyarország) a vesét egy 1-2 cm-es dorzális bemetszésen át kiemeltük. Az a. carotisba adott 70 kDa Rodamin Dextrán festi az ereket, a Texas Red az ép kefeszegélyt jelöli, Hoechst 33342- vel kékeka sejtmagok (flurofórok: LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA). A tubulusok autofluoreszcenciájukból adódóan zöldek (20. ábra). Elemeztük az intakt kefeszegély jelenlétét, a sejtmagok integritását, és a tubulusok lumenében felhalmozódó nekrotikus szövettörmelék előfordulását. A pertibuláris kapillárisok átmérőjének változását egy 30 perces periódusban követtük nyomon, a folyamatos mérés során percenként készítettünk képet ugyanarról a látótérről, majd ugyanazokat az ereket mértük le. Az 1., 10., 20. és 30. percben mért érátmérők közti különbséget kvantifikáltuk. Állatonként kb. 150 kapillárist mértünk le. A képeket Matlab (Femtonics Kft, Budapest, Magyarország) és Image J (The National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) szoftverek segítségével értékeltük ki (20. ábra).

20. ábra Két-foton mikroszkópos felvétel Az állat a két-foton mikroszkópban, (B) peritubuláris kapillárisok érátmérőjének mérése (C) Tubulus képe Piros: vesekapillárisok, kék: sejtmag zöld: autofluoreszcencia, lépték: 200 m.

Kísérlet során készült saját felvétel (Dr. Hosszú Ádám)

A. B.

C.

IV.3.1.2. SPECT- MRI

Az agyi perfúzió és mikroglia aktiváció egyidejű vizsgálatára Single Photon Emission Computed Tomography-Magnetic Resonance Imaging (SPECT-MRI) képalkotó eljárást alkalmaztunk a Biofizikai és Sugárbiológiai Intézettel Kooperációban. A méréseket Dr. Máthé Domokos és Dr. Szigeti Krisztián végezte. A vizsgálat során az állatokat izoflurán-oxigén elegyével végig altatásban tartottuk (amíg el nem aludt az állat 3,5-4% izofluránt alkalmaztunk, majd ezt lecsökkentettük 1,5%-ra a képalkotás idejére). A mérések előtt 14 mg/ttkg kálium-perklorátot (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ip. injektáltunk az állatokba, hogy elkerüljük pajzsmirigy szabad [125I]-iodine felvételét. Az állatoknak először 9.35 ± 2.00 MBq 125I-jelölt 6-kloro-2-(4′-iodofenil)-3-(N,N-mmetiletil)imidazo[1,2-a]pyridine-3-acetamie ([125I]CLINME) radioaktív izotópot adtunk (Progressio, Budapest, Magyarország), majd 30 perccel később 135.86 ± 6.84 MBq 99mTc-jelölt hexametil-propilénamin. oxim ([99mTc]HMPAO) (Medi-Radiopharma, Érd, Magyarország) izotópot juttatunk be. A [99mTc]HMPAO injektálása után végeztük el az MRI mérést nanoScan 1T MRI rendszerrel (Mediso, Budapest, Magyarország), mely során T1-súlyozású GRE 3D szekvenciát alkalmaztunk (460 μm in-plane felbontás, metszet vastagság 500 μm, TR/TE 1262 ms, TD 20 μs és négy excitátiós eredmény egy 9,5 perces mérésnél).

A SPECT-CT méréseket NanoSPECTCT PLUS gépen (Mediso, Budapest, Magyarország) végeztük el, és az eredmények kiértékelését a MBq/ml-ben mért rádioaktivitás egységeként (0,33 mm, izovoxel) határoztuk meg. Az MRI mérések során egy atlasz-alapú módszert alkalmaztunk az egyes agyi régiók (kamrák, kisagy, kortex, hippokampusz, striátum, bulbus olfactorius) és az egyes kiválasztott kisebb területek (VOI) vizsgálatára.

A [99mTc]HMPAO jelölés során mértük az egyes agyi szegmensek standardizált felvétel értékeit (SUV). A [125I]CLINME jelölés esetében meghatároztuk a szövetben mért aktivitás és az artériás vérben mért aktivitás arányát a vizsgált kiválasztott agyi szegmenseknél. Ehhez a kép-alapú artériás vérben mért aktivitási koncentrációt vettük alapul. A kapott adatokat a saját régióban mért [99mTc]HMPAO SUV értékekre normalizáltuk. A 3D SPECT VOI képeinek elemzését VivoQuant 1.22 patch2 szoftverrel (InviCRO, Boston, MA, USA) végeztük.

IV.3.2. Vérnyomás- és pulzusmérés

Az állatok artériás vérnyomását és pulzusát CODA Standard tail-cuff monitoring™ (EMKA Technologies, Párizs, Franciaország) módszerrel mértük 37°C-os melegítőpárnán 3% izoflurán és szintetikus levegőelegy (Eickemeyer Veterinary Equipment Ltd., Twickenham, Egyesült Királyság) belélegeztetésével végzett altatásban. A vérnyomás és pulzusmérésre alkalmas gyűrűs mandzsettákkal mértük a szisztolés és a diasztolés vérnyomást, valamint a pulzust. Az artériás

középnyomás értékét a szisztolés és diasztolés értékekből számoltuk ki. Minden állatnál több alkalommal, legalább 3 mérést végeztünk. A tail-cuff monitoring rendszer előnye, hogy nem invazív, így kisebb megterhelést jelent az állatoknak, emellett pontossága közel 95%-ban egyezik a gold standardként használt telemetriás eljárással.

IV.3.3. Viselkedési tesztek

A depresszió tanulmányozására akut és krónikus állatmodellek is rendelkezésre állnak. Mivel a stressz a depressziós epizódok kialakulásának fontos kiváltó tényezője, a depresszió állatmodelljeiben főként krónikus enyhe stressz (nedves alom, megbillent ketrec), szociális stressz vagy farmakológiai szerek révén idézik elő a depresszió-szerű viselkedést [208]. Az akut modelleket leginkább az új antidepresszáns gyógyszerek tesztelésére fejlesztették ki, ahol sokszor stresszhatás nélkül vagy akut stressz kiváltását követően vizsgálják a gyógyszerekre adott mozgásmintázat változásokat. A depresszió neurobiológiai elváltozásainak tanulmányozását krónikus stressznek kitett állatokon vizsgálják, mely alkalmas a kialakuló központi idegrendszeri strukturális elváltozások feltárására is. Ilyen krónikus stresszállapot okozta depresszió alakul ki DM hosszútávú fennállása során is, bár a cukorbetegség nem klasszikus modellje a depressziónak.

A depresszió komplex viselkedésmintázat, tanulmányozására többféle tesztet kifejlesztettek, melyek mindegyike a depresszió egy-egy jellegzetes tünetének megfigyelésére alkalmas. DM-ben egyes tesztek használhatósága limitált, hiszen pl. az egyik legelterjedtebb viselkedési teszt a cukor preferencia teszt – melyben az anhedónia jelenségét pozitív megerősítésre, jutalomra csökkent válasszal modellezik – cukorbeteg állatokban nem használható. Az STZ-indukált T1DM patkánymodellben a depresszió megállapítására leginkább alkalmazott viselkedési teszt a Porsolt-féle erőltetett úszás teszt [209]; vizsgálataink során mi is ezt használtuk.

IV.3.3.1. Erőltetett úszás teszt

A magatartásteszteket erre a célra elkülönített, gyengén megvilágított (15W), 21°C hőmérsékletű szobában végeztük. Az állatokat randomizáltuk, mivel a nagy elemszám miatt nem volt lehetőség az összes állat egy napon történő vizsgálatára. A méréseket minden nap ugyanabban az időpontban végeztük, minimálisra csökkentve a környezeti változók variabilitásának hatását.

A Porsolt-féle erőltetett úszás teszt során az állatokat 24 ± 1°C-os csapvízzel feltöltött üveghengerekbe (átmérő: 30 cm; magasság: 60 cm, vízszint: 40 cm) tettük. Az előzetes tesztnél 15 percig, a teszt periódusban pedig 5 percig Sony DCR-SX21E digitális videokamerával rögzítettük a viselkedésüket. A hengereket minden vizsgálat után kiöblítettük és friss vízzel töltöttük fel (21. ábra).

Elemzéskor két független vizsgáló vakon értékelte ki a négyféle viselkedési paraméter időszázalékát a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet által fejlesztett és validált H77 szoftverrel.

Viselkedési paraméterek: lebegés (az állat nem mozog azon kívül, ami szükséges a fej vízszint fölött tartásához), kapálózás (az állat erőteljes végtagmozgások, a mellső végtagok megtörik a vízfelszínt és kaparó-szerű mozgást végeznek a henger falán), úszás (koordinált, aktív helyváltoztató mozgás, mely során a végtagok nem törik meg a vízfelszínt), illetve búvárkodás (az állat egész testével lebukik a vízfelszín alá) [210]. Az adatok kiértékeléskor a mozgásformákat két nagyobb csoportra osztottuk, ahol a kapálózás, úszás és búvárkodás időszázalékának összege a mobilitási, míg a lebegés ideje az immobilitási paramétert jellemzi (11. ábra).

21. ábra Erőltetett úszás teszt Kísérlet során készült saját felvétel (Dr. Lénárt Lilla)

IV.3.3.2. Porond teszt

A porond teszt a legelterjedtebb módszer a laboratóriumi rágcsálók lokomotoros aktivitásának és felderítő magatartásának meghatározására [211]. A vizsgálatokat egy 100 x 100 x 60 cm-es, átlátszó plexilapokkal körülvett dobozban végeztük, melynek alja 10 x 10 cm-es négyzetekre van osztva. A patkányokat középre tettük és 10 percen át videóra rögzítettük a viselkedésüket. Az elemzés során a vonal átlépések számát határoztuk meg. (22. ábra).

22. ábra Porond teszt Kísérlet során készült saját felvétel (Dr. Lénárt Lilla)

IV.4. Szérumból, vizeletből laboratóriumi végzett mérések