A holo és az apo szerkezetek közötti konformációs átmenet jellemzése

Az irodalomban jelenleg nincs egyetértés arra vonatkozóan, hogy a két NBD egymástól való disszociációja megtörténik-e kötött ATP vagy ADP esetén [65]. A szimulációkban ha mindkét kötőhelyen ATP szerepel, jelentős disszociáció nem figyelhető meg (16. ábra). Ha a B lánc kötőhelyén a nukleotidot ADP-re cseréljük, mindkét kötőhely

nagyobb flexibilitást mutat, és a másik kötőhely gyakrabban mutat eltávolodást a kezdeti szerkezettől. Ez jelezheti azt, hogy az ATP hidrolízise az innenső (cis) kötőhelyen befolyásolja a túlsó (trans) kötőhely viselkedését, és gyengítheti a túlsó domén nukleotidkötését. Ennek ellenére a disszociáció jelzésére használt két oldallánc között a legnagyobb eltávolodás is csak 4 Å, ami alapján nem állapítható meg egyértelműen, hogy a két domén disszociál-e az ATP/ADP rendszerben. Ennek oka lehet az, hogy az NBD-k disszociációját leíró tanulmányokkal szemben szimulációnkban nem pusztán a két nukleotidkötő domén van jelen, hanem a teljes hosszúságú fehérje. A transzmembrán domének korlátozhatják az NBD-k mozgását, ezáltal akadályozva a disszociációt.

16. ábra. Az NBD-k nem disszociálnak jelentős mértékben sem két ATP, sem egy ATP és egy ADP jelenléte esetén. A Ser381A és Ser479B („A” kötőhely) és a Ser381B és Ser479A („B” kötőhely) C_α atomjainak távolsága látható az ábrákon a szimulációs idő függvényében. Ez a távolság az NBD-k szétnyílását jellemzi a két nukleotidkötő helyen, a dupla ATP-kötött rendszerre (felső két panel) és az ATP/ADP kötött rendszerre (alsó két panel). Az ATP/ADP rendszerben a „B” kötőhelyen levő ATP lett ADP-re cserélve. Az eltávolodás egyik esetben sem haladja meg 2–4 Å értéket (d ≤ 12,5 Å), aminek oka az lehet, hogy a jelen lévő TMD-k akadályozzák az NBD-k disszociációját.

Sok fehérjében már egy rövid molekuláris dinamikai szimuláció során tapasztalhatóak olyan kollektív mozgások, amelyek a fehérje funkciójához köthető elmozdulásokat mutatnak [112, 113]. Annak érdekében, hogy az ABC exporterek holo és apo konformációi közötti

nyitó átmenethez kapcsolható esetleges belső mozgásokat jellemezni tudjam, az „alul nyitott”

és „alul zárt” konformációval is végeztem szimulációkat. Mivel jelenleg nincs olyan transzporter, amelynek mindkét konformációban rendelkezésre állna atomi felbontású, kísérletileg meghatározott szerkezete, a számításokhoz a humán MDR1 két homológiamodelljét használtam. Az „alul zárt” szerkezet esetében elhagytam a nukleotidokat a kötőhelyekről, ezzel is elősegítve az „alul nyitott” forma felé vezető átmenetet. A releváns kollektív mozgások meghatározását az esszenciális dinamika (ED) módszerével végeztem, amely az atomi fluktuációk főkomponens-analízisén alapul [112]. A számított főkomponensek a rendszer egy-egy lineárisan független kollektív mozgását (módusát) írják le.

Ebből kiválasztható a módusoknak egy olyan részhalmaza, amely azt az ún. esszenciális alteret feszíti ki, ahol a fehérje funkció szempontjából releváns mozgásai történnek. A hMDR1 holo konformáció esetén az apo konformáció felé történő átmenethez legjobban illeszkedő esszenciális módusokat rendszerint kevés számú kollektív mozgási módus választásával kaptam (lásd 3.8. fejezet és 17. ábra). A kiválasztott módusok szuperponálásával megkapjuk a fehérjének a szimuláció során az esszenciális alterében végzett kollektív mozgásait. A kapott összetett módus által meghatározott kollektív mozgásban a C_α atomok kezdeti elmozdulása a 18. ábrán látható. Mindhárom szimuláció esetén az összetett módusban megfigyelhető volt egy záródó és csavarodó mozgás a transzmembrán régióban, amely ezt a régiót az „alul nyitott” szerkezet felé mozgatja, és az extracelluláris oldal záródásának felel meg (18. ábra). A 18. ábrán bemutatott móduson megfigyelhető, hogy ehhez a mozgáshoz csatolva az NBD-k oldalirányú mozgást végeztek, merőlegesen a tömegközéppontjukat összekötő tengelyre. Ez a mozgás a holo és apo szerkezetek összehasonlításából nem következik, és a holo konformációt egy „alul zárt” apo konformáció felé mozgatja. Az NBD-k ehhez hasonló, oldalirányban elcsúsztatott elhelyezkedése figyelhető meg az MsbA transzporter „alul zárt” apo (PDB ID: 3B5X) röntgendiffrakciós szerkezetében. Az „alul zárt” apo konformációban az NBD-k közötti kapcsolatok fellazulnak, de a két domén közötti távolság nem akkora, mint az „alul nyitott”

apo konformációban. A megfigyelt kollektív mozgás, bár csak háromból egy szimuláció esetén fordult elő, azt mutatja, hogy a holo fehérje képes egy „alul zárt” konformáció felé tartó közvetlen átmenetre, és nem feltétlenül van szükség az NBD-k egymástól való nagymértékű eltávolodására. A másik két szimulációban nem volt megfigyelhető olyan esszenciális altér, amelyben az NBD-k elmozdulása az „alul nyitott” apo állapot felé vezetett volna.

17. ábra. A holo–apo konformációs átmenetet jellemző kollektív módusok kombinációjának meghatározása. (A) A nukleotid nélküli holo hMDR1 rendszerre számolt alacsony frekvenciájú (< 200 cm^-1) kollektív módusok a holo–apo konformációs átmenet irányával való átfedése a módusok frekvenciájának függvényében (ld. 3.8. fejezet). Magas átfedéssel rendelkező módusok főleg az alacsony frekvenciájú tartományban találhatók. (B) Az első n, legnagyobb átfedést mutató módus szuperponálásával kapott összetett módus átfedése a holo–apo konformációs átmenettel, a szuperponált módusok számának (n) függvényében. A két legnagyobb átfedéssel rendelkező módus kombinációja adja a holo szerkezetből az apo szerkezet felé mutató elmozdulás legjobb közelítését. A beillesztett ábrák a grafikonok kezdeti szakaszainak nagyítását mutatják.

18. ábra. Az esszenciális dinamikai (ED) módusok szuperpozíciója meghatároz egy átmeneti irányt a holo konformációból az apo konformáció felé. Az esszenciális alteret meghatározó két kollektív módus szuperpozíciója látható az ábrákon. Az egyes C_α atomok elmozdulásának irányát és relatív nagyságát a fekete vektorok jelzik. Az oldalnézet (A) mutatja az NBD-k egymástól való távolodását. Az elforgatott nézeten (B) látható a transzmembrán régió extracelluláris (felső) szakaszainak záródása. Alulnézetben (C) látható az NBD-k oldalirányú kitérése, amely a rendszert az MsbA fehérje esetén megfigyelt „alul zárt” apo konformáció (PDB ID:

3B5X) irányába mozgatja.