Munkánk során az Osborne-szerinti frakcionálást alkalmaztuk, azzal a módosítással, hogy a víz- és só-oldható frakciót (albumin-globulin) együtt nyertük ki a búzalisztből. A frakciók fehérje tartalmát Bradford módszerrel mértük.
III. 2. 1. 2. Búzafehérjék hidrofób tulajdonság szerinti szeparálása
A víz- és só-oldható fehérjéket hidrofób jellegük alapján 5 alfrakcióra szeparáltuk Octyl Sepharose CL-4B oszlopon (Amersham Biosciences) 2 lépésben (3. ábra). Az oszlop ekvilibrálását desztillált vízzel végeztük. A kromatográfiás elválasztás első lépésében a minta injektálása után az oszlophoz nem kötődő fehérjéket desztillált vízzel mostuk le. Majd etilén glikollal (50%; v/v) eluáltuk a közepesen hidrofób (4. alfrakció), illetve karbamiddal (7 M) a leginkább hidrofób (5.
alfrakció) fehérjéket. Ezt követően az oszlopról desztillált vízzel lemosott fehérje frakcióhoz ammónium-szulfátot adagoltunk, 1,2 M koncentráció eléréséig. Az így nyert fehérjeoldatot az elválasztás második lépésében ugyanazon az Octyl Sepharose oszlopon szeparáltuk további alfrakciókra. Ammónium-szulfátos (1,2 M) ekvilibrálás után ammónium-szulfáttal eluáltuk a hidrofil (1. alfrakció), desztillált vízzel a közepesen hidrofil (2. alfrakció) és etilén glikollal (50%;
v/v) a kismértékben hidrofób (3. alfrakció) fehérjéket.
(NH4)2SO4
Octyl Sepharose CL-4B
Oszlophoz nem kötődő fehérjék 4. alfrakció
(közepesen hidrofób)
Oszlophoz nem kötődő fehérjék 4. alfrakció
(közepesen hidrofób)
A hidrofób kölcsönhatási kromatográfia lépései
III. 2. 1. 3. Búzafehérjék szeparálása egydimenziós gélelektroforézissel
A molekulatömeg szerinti elválasztást NuPAGE Bis-Tris 12% akrilamid tartalmú gélben (Invitrogen) végeztük. A mintaoldáshoz NuPAGE LDS 4X (Invitrogen) mintaoldó puffert és NuPAGE 10X (Invitrogen) redukáló ágenst alkalmaztunk, amellyel 0,03 mg/ml fehérje koncentrációt állítottunk be. Az elektroforézishez NuPAGE SDS (Invitrogen) puffert használtunk.
Elektroforézis paraméterei:
feszültség (konstans): 200 V áramerősség (limit): 200 mA futtatás ideje: 50 perc
Fehérjedetektálás
A fehérjéket ezüst festési eljárással detektáltuk SilverXpress® Silver Staining Kit (Invitrogen) alkalmazásával, a gyártó szerinti protokollt követve.
III. 2. 1. 4. Búzafehérjék szeparálása kétdimenziós gélelektroforézissel
A búzafehérjéket (+/- 100µg) első dimenzióban pH 3-10 vagy pH 6-11 tartományban fókuszáltuk. A stripeket (Amersham Biosciences) egy éjszakán keresztül rehidratáltuk 7 M karbamidot, 2 M tiokarbamidot, 2% CHAPS-t, 0,5%(v/v) amfolitot pH 3-10 vagy pH 6-11, 0,28%
DTT-t, 0,001% brómfenolkéket tartalmazó pufferban. Az izoelektromos fókuszálást 11 mA/strip áramerősségen, 80 000 Vh felvételéig végeztük 5000 V maximumon. A második dimenzió előtt a stripeket equilibráltuk 3 M karbamidot, 3,3% SDS-t és 30% glicerolt tartalmazó 0,2 M Trisz-acetát pufferben (pH: 8,8) első lépésben 0,8% DTT jelenlétében 30 percig, majd 2,5% iodoacetamid jelenlétében szintén 30 percig. A második dimenzióban a fehérjéket 28 x 23cm x 1mm 10% SDS-PAGE gélben szeparáltuk 500V feszültségen, 20W/gél mellett 4 óra alatt, 0,2 M Trisz, 0,2 M Tricin, 0,4% SDS tartalmú katód pufferben és 0,13 M Trisz-acetát anód pufferben.
Szeparáló gél (10%, 6 nagy gélre):
Duracryl 30,65% Bis (Genomic Solution) 222 ml
1,5 M TRISZ-HCl (pH: 8,8) 166 ml
10% SDS 7 ml
Desztillált víz 274 ml
TEMED 0,335 ml
Ammónium-perszulfát (100 mg/ml) 1,7 ml
Fehérjedetektálás
A molekulatömeg szerinti elválasztás után a fehérjéket egy éjszakán keresztül fixáltuk 40%
metanolt, 10% ecetsavat tartalmazó oldatban. A fehérjéket Sypro Ruby (Bio-Rad) festékkel detektáltuk. A gélt 90 percig rázattuk a festékoldatban, majd 10% metanol, 6% ecetsav oldattal távolítottuk el a háttérben maradt felesleges festéket. A gélképeket proXPRESS Proteomic Imaging System (Perkin Elmer Life Sciences) készülékkel rögzítettük.
III. 2. 1. 5. Fehérjeazonosítás MALDI-MS alkalmazásával
In situ emésztés
A fehérje-foltok kivágását ProPick Spot Picker készülékkel HT Analyzer software (Genomic Solutions) segítségével végeztük, a tripszines emésztést pedig ProGest Protein Digester (Genomic Solutions) készülékben. Első lépésben 200 mM ammónium-bikarbonát/50 % acetonitril oldattal eltávolítottuk a Sypro Ruby festéket a gélből, majd 25 mM ammónium- bikarbonát oldattal equilibráltunk. A fehérjéket 37°C-on, 3 órán keresztül hidrolizáltuk 50ng tripszin (Promega) hozzáadásával, a reakciót 5% hangyasavval állítottuk le. A mintákat –70°C-on tároltuk a tömegspektrometriás analízisig.
MALDI-MS
A fehérjeminták tömegspektrometriás elemzését a John Innes Centre (Norwich, UK) intézetében végezték Bruker Reflex III MALDI-TOF MS készüléken (Bruker-Daltonics, Bremen, Germany) pozitív ion reflektor módban.
A fehérjéket peptidtömegek alapján az NCBI Mascot programjával (Matrix Science;
http://www.matrixscience.com/) azonosítottuk. A keresési paraméterek a következők voltak:
- taxonómia: zöld növények, - felhasznált enzim: tripszin,
- fix módosutás: ciszteinek karbamidometilezése, - változó módosulás: metionin oxidációja,
- tömeg tolerancia: 50 ppm
III. 2. 2. Szülői és transzgénikus búza vonalak fehérjéinek proteomikai vizsgálata III. 2. 2. 1. Növényi anyag, szövetkultúra és transzformáció
(Halász és mtsai., 2007)
A genetikai transzformációs kísérletek recipiens genotípusa a ’CY-45’ tavaszi búza volt, amit a szomatikus szövetkultúrában adott fokozott válasz miatt már korábban szelektáltak. A donor növényi anyagot standard búzatermesztő program szerint fitotron kamrákban és üvegházban
termesztették. Az anthesis 12. napja után az éretlen embriókat a korábban leírt módon kimetszették.
Kallusz indukcióhoz D2 közeget használtak. A szelekcióban, a bombázott kallusz anyag első és második ciklusa alatt a D2 közeget 5 és 10 mg/l bialaphos-szal (Shinyo Sangyo Co., LTD) egészítették ki, külön-külön. A kiválasztott szomatikus búza kallusz kultúrából a feltételezett transzformánsok regenerálását egy korábban publikált protokol szerint végezték.
A kallusz anyagból származó három hetes embriókat alkalmazták genetikai transzformáció céljára. A transzformációs rendszer optimalizálásához tranziens expressziós kísérleteket végeztek az UidA riporter gént és a bar markergént tartalmazó pAHC25 plazmiddal. A stabil transzformációs kísérletekben a herbicid (Finale 14SL, 150 g/l ammónium glufozinát) rezisztenciára választható bar gént tartalmazó pAHC20 plazmidot alkalmazták. A regenerált növényeket fitotron kamrába transzplantálták és a transzformált gént (bar) 0,5 % Finale 14SL permetezéssel és Southern blot analízissel ellenőrizték. A ’T-117’, ’T-106-3/a’ és ’T-128’ transzgénikus búza vonalak egy integrációs helyű transzformánsok. Ezek a vonalak következésképpen önbeporzók és a generációk mindegyike herbicid (Finale 14SL) kontrol alatt fejlődött. Mindezek a transzgénikus vonalak: ’T-117’, ’T-106-3/a’ és ’T-128’ T4 generáció után teljesen homogének voltak a transzformált bar génre.
Üvegházi kísérletek
A szárazság-stressz beállítása a szülői ‘CY-45’ és a transzgénikus vonalakra ‘T-117’, ‘T-106-3/a’,‘T-128’ 2003 márciusában, üvegházban történt. A növény optimális fejlődéséhez elegendő vízmennyiségének egyharmadával látták el a vizsgált búza vonalak kéthetes növénykéit. A magérés idején (június, július) az üvegházban 30-35 Co-ot mértek.
A szárazság-stressz hatására a búza vonalak termékenysége csökkent. A szülői ‘CY-45’ és a transzgénikus vonalakból ‘T-117’, ‘T-106-3/a’,‘T-128’ 24-24 növényt arattak le.
III. 2. 2. 2. Búzafehérjék oldhatóság szerinti frakcionálása
Munkánk során az Osborne-szerinti frakcionálást alkalmaztuk, azzal a módosítással, hogy a víz- és só-oldható frakciót (albumin-globulin) együtt nyertük ki, a vizsgált minták szemcsemérete 0,15 mm alatti volt. A frakciók fehérje tartalmát Bradford módszerrel mértük.
III. 2. 2. 3. Kétdimenziós gélelektroforézis
Az első dimenzióban a fehérjéket izoelektromos pontjuk alapján szeparáltuk immobilizált pH gradienst tartalmazó stripen. A mintákat rehidratáló pufferben oldottuk (8 M karbamid, 1%
CHAPS, 20 mM DTT), majd 150 µg fehérjét vittünk fel a 17 cm-es stripekre, aktív rehidratálást követően 60 000Vh felvételéig fókuszáltuk BIO-RAD PROTEAN IEF CELL készüléken. A molekulatömeg szerinti poliakrilamid gélben történő elválasztás előtt a stripeket equilibráltuk karbamidot (6 M), SDS (2%) és glicerolt (20%) tartalmazó Trisz-HCl pufferben első lépésben DTT (130 mM) jelenlétében 20 percig, majd jódacetamid jelenlétében (135 mM) szintén 20 percig.
Második dimenzióban a fehérjéket vertikális SDS-PAGE-n BIO-RAD PROTEAN II xi Cell készüléken szeparáltuk.
Fehérjedetektálás
A molekulatömeg szerinti elválasztást követően Coomassie Blue R-250-el detektáltuk a fehérjéket. Az elektroforézis befejezése után a szeparált fehérjéket 20 percig fixáltuk 20% triklór-ecetsav oldatban. A maradék TCA eltávolításához 3-szor 10 percig rázattuk a géleket PAGE-mosó oldatban (10% etanol, 5% ecetsav). Ezután 10 percig Coomassie festékoldatban (0, 2% Coomassie R-250, 45% etanol, 9% ecetsav) rázattuk a gélt, majd 10% ecetsav oldattal távolítottuk el a háttérben maradt felesleges festéket. A kapott géleket Gel Doc 2000 (Bio- Rad) rendszerrel dokumentáltuk.
III. 2. 2. 4. Fehérjeazonosítás MALDI-MS alkalmazásával
In situ emésztés
A gélből kivágott (manuálisan) mintákból első lépésben eltávolítottuk a Coomassie festéket, háromszor átmostuk 25 mM ammónium-bikarbonát/50% acetonitril oldattal (10 percig), majd eltávolítottuk a felülúszót. A fehérjéket az enzimes hidrolízis előtt redukáltuk (25µl, 10 mM DTT/25 mM ammónium-bikarbonát, 0,5 h, 56°C), majd alkiláltuk (25µl, 55 mM jódacetamid/25 mM ammónium-bikarbonát, 30 min, szobahőmérséklet). A mintákhoz 100 ng tripszint (sequencing grade, modified trypsin, Promega GmbH, Mannheim, Germany) tartalmazó 20 µl puffert (50 mM ammmónium-bikarbonát) adtunk, a hidrolízist 37˚C-on (4 óra) végeztük. A tömegspektrometriás analízis előtt ZipTipC18 tisztítást végeztünk (Millipore, Bedford, MA, USA).
Fehérjeazonosítás tömegspekrometria segítségével
A MALDI TOF MS vizsgálatot DHB mátrix (2,5- dihidroxi-benzoesav) jelenlétében végeztük. A mérést Bruker Reflex III MALDI-TOF MS készüléken (Bruker-Daltonics, Bremen, Germany) pozitív ion reflektor módban végeztük. A tripszin autolízis termékeit használtuk belső kalibrációhoz.
A fehérjéket peptidtömegek alapján az NCBI Mascot programjával (Matrix Science;
http://www.matrixscience.com/) azonosítottuk. A már a III. 2. 1. 5. pontban ismertetett paraméterek alapján. Néhány esetben kiegészítő analízisre került sor MS Fit programmal (UCSF;
http://prospector.ucsf.edu/).
MALDI Ion-trap MS/MS analízishez a mátrix, CHCA (α-ciano-4-hidroxi-fahéjsav) és a szolvens (24% izopropanol, 75% víz, 1% ecetsav) 1:1 arányú keverékét alkalmaztuk. A méréseket Agilent atmospheric pressure MALDI (AP-MALDI II) ionforrással felszerelt Agilent XCT Plus ion trap MS analizátoron végeztük.
III. 2. 2. 5. Elektroforetikus blot technika és immunreakció
A blottolás a fehérjék szintetikus membránon történő megkötését jelenti, amelyet a membránon specifikus detektálás követ. A leghatékonyabb blottolási technika, amit Western módszernek neveznek, alkalmazása során első lépésben a fehérjéket elektroforetikusan választják el. Az így kapott felbontás a membránon is stabil marad, ami a módszer nagy előnye.
Az elektroforetikus elválasztás után a poliakrilamid gélt és a 0,45 µm pórusméretű nitrocellulóz membránt (Bio-Rad) 25 mM TRISZ-t, 192 mM glicint, 20% metanolt, és 0,1% SDS-t tartalmazó Towbin pufferben 10 percig equilibráltuk. Az SDS-poliakrilamid- gélelektroforézissel szeparált fehérjefrakciókat BIO-RAD Trans Blot SD Semi-Dry Transfer Cell készülékkel nitrocellulóz membránra vittük át. A blottolási idő 90 perc a blottolási feszültség 25 V, az áramerősség pedig 0,8 mA/cm2 volt. Az immunreakciókhoz humán szérumokat használtunk. A vizsgálatokhoz felhasznált humán szérumok klinikailag igazolt hátterű gabona-allergiás betegektől származtak.
Az immunfestés lépései a következők voltak:
• 5 perc fixálás 25% glutáraldehidet tartalmazó mosó-inkubáló pufferben
• 30 perc inkubálás fedőpufferben (2% Tween-20 mosó- inkubáló pufferben oldva)
• 3 x 10 perc mosás (mosó- inkubáló puffer: 0,05 M TRIS, 0,15 M nátrium-klorid, 0,1 mM fenil- metil- szulfonil-fluorid, 0,05% Tween-20).
• 16 óra inkubálás humán antitestet tartalmazó mosóoldattal
• 3 x 10 perc mosás mosó- inkubáló pufferrel
• 1,5 óra inkubálás peroxidáz enzimmel jelzett anti-humán IgE ellenanyagot tartalmazó mosóoldattal
• 3 x 10 perc mosás mosó- inkubáló pufferrel
• 5 perc inkubálás hideg foszfát pufferben (135 mM nátrium-klorid, 2 mM kálium-klorid, 16 mM dinátrium-hidrogén-foszfát 2-hidrát, 2 mM kálium-dihidrogén-foszfát)
• előhívás: 4-kloro-naftollal hidrogén-peroxid jelenlétében (30 mg 4-kloro-naftol 10 ml etanolban oldva,+50 ml PBS oldat+200 µl 37% hidrogén-peroxid).
III. 2. 3. Marko tritikále proteomikai vizsgálata
III. 2. 3. 1. Tritikálefehérjék oldhatóság szerinti frakcionálása
Marko tritikále virágzás után 7., 14., 21. és 28. napon learatott mintáinak fehérjéit Osborne-szerinti frakcionálással szeparáltuk. A gabonaszemeket Hagberg-Perten darálón őrölték meg, 0,8 mm perforációs méretű szita használatával. A teljes őrleményeknek a szemcsemérete tehát ez alatti volt. A víz- és só-oldható frakciót (albumin-globulin) együtt nyertük ki. A frakciók fehérjetartalmát Bradford módszerrel mértük.
III. 2. 3. 2. Tritikálefehérjék szeparálása egydimenziós gélelektroforézissel
A minta előkészítése
Kettő mg liofilizált mintát 150- 250 µl mintaoldó pufferben (Mintaoldó puffer: 3% SDS; 62 mM TRISZ; 8,7% glicerin (87%); 10% β-merkapto-etanol, pH: 6,8) oldottunk. Az oldatot 5 percig forraltuk, majd a gélre 3-15 µl előkészített mintát vittünk fel.
A vizsgálatokat Bio-Rad Mini-PROTEAN 3 Cell készüléken végeztük.
Elválasztó gél (12 %, 2 kis gélre):
30% akrilamid/ bis-akrilamid 29: 1 (Bio-Rad) 3,2 ml
2 M TRISZ-HCl (pH: 8,8) 1,8 ml
10% SDS 50 µl
Desztillált víz 2,85 ml
TEMED 6 µl Ammónium-perszulfát (100 mg/ml) 50µl
A gél polimerizálódása után a tetejére gyűjtőgélt öntöttünk, amibe elhelyeztük a mintafelvivő zsebek kialakításához szükséges fésűt.
Gyűjtőgél (6%, 2 kis gélre):
30% akrilamid/bis-akrilamid 29: 1 (Bio- Rad) 0,5 ml
10% SDS 27,5 µl
0,5 M TRISZ-HCl (pH: 6, 8) 0,33 ml
Desztillált víz 1,6 ml
TEMED 3 µl
Ammónium-perszulfát (100 mg/ml) 25 µl.
A mintafelvitelt követően a gélt elektroforézis cellába helyeztük. Pufferrel történő feltöltés után a cellát áram alá helyeztük.
Elektroforézis puffer:
TRISZ 3,03 g
SDS 1,0 g
Glicin 14,4 g
1000 ml-re feltöltve desztillált vízzel.
Elektroforézis paraméterei:
feszültség (konstans): 200 V áramerősség (limit): 400 mA futtatás ideje: 50-70 perc
Fehérjedetektálás
Az elválasztást követően Coomassie Blue R-250-el detektáltuk a fehérjéket azonos módon a III. 2. 2. 3. pontban ismertetekkel.
III. 2. 3. 3. Tritikálefehérjék biológiai aktivitásának vizsgálata
Az elektroforetikus blot és az immunreakció paraméterei megegyeznek a III. 2. 2. 5. pontban leírtakkal. Azzal a kiegészítéssel, hogy egydimenziós elválasztást követően a blottolási idő csak 60 perc.
A tritikálefehérjék IgE-kötő képességének kimutatásához klinikailag igazolt hátterű gabona-allergiás betegektől származó szérumot használtunk. Az immunreakciót peroxidáz enzimmel jelzett anti-humán IgE ellenanyag segítségével detektáltuk.
Az IgA-kötő képesség vizsgálatához klinikailag igazolt hátterű cöliákiás betegektől származó szérumot használtunk. Az antigén-antitest kialakulását peroxidáz enzimmel jelzett anti-humán IgA konjugátummal mutattuk ki.
A tritikálefehérjék búza gliadin antitesttel szembeni immunreakcióját nyúlban kifejlesztett anti-gliadin antitesttel és peroxidáz enzimmel jelzett anti-nyúl IgG ellenanyaggal követtük nyomon.
III. 2. 3. 4. Tritikálefehérjék szeparálása kétdimenziós gélelektroforézissel
A 2-DE vizsgálat menete megegyezik a III. 2. 2. 3. pontban ismertetekkel. Azzal a kiegészítéssel, hogy tritikáleminták esetében a fehérjéket első dimenzióban pH 3-10 tartományban fókuszáltuk és a 40 µg fehérjét vittünk fel a 7 cm-es stripekre.
III. 2. 3. 5. Fehérjeazonosítás MALDI-MS alkalmazásával
A vizsgált fehérjék in situ emésztése és tömegspektrometriás meghatározása III. 2. 2. 4.
pontban leírtaknak megfelelően történt.
III. 2. 4. Árpa vonalak elektroforetikus vizsgálata
A vizsgált tavaszi árpafajták (Scarlett, Jubilant, Pasadena, Mandolina) kontroll mintáit csapadékellátás szempontjából optimális körülmények között termesztették Sopronhorpácson. A szárazság-stressz beállítása Táplánszentkereszten történt, egy speciális talaj előkészítés eredményeként, ezáltal a növények vízellátottsága nem volt optimális. Az árpaszemeket Hagberg-Perten darálón őrölték meg, 0,8 mm perforációs méretű szita használatával. A teljes őrleményeknek a szemcsemérete tehát ez alatti volt.
III. 2. 4. 1. Árpafehérjék extrakciója
A kioldható összes fehérje izolálását ún. lysis-pufferrel végeztük. Egy súlyrész törethez 10 térfogatnyi puffert adtunk (7 M karbamid, 2 M tiokarbamid, 4% CHAPS) és 30 percen át rázógépen rázatva extraháltuk. A kapott szuszpenziót 12 000 RPM-en, 20 percig centrifugáltuk. A felülúszót alikvotokra szedve -70˚C-on tároltuk.
III. 2. 4. 2. Árpafehérjék szeparálása kétdimenziós gélelektroforézissel
A 2-DE vizsgálat menete megegyezik a III. 2. 2. 3. pontban ismertetekkel. Azzal a kiegészítéssel, hogy árpaminták esetében a fehérjéket első dimenzióban pH 3-11 tartományban fókuszáltuk és a 40 µg fehérjét vittünk fel a 7 cm-es stripekre.
III. 2. 5. Baktériumfehérjék proteomikai vizsgálata III. 2. 5. 1. Baktériumfehérjék izolálása
A Shewanella hanedei baktériumot aerob körülmények között tenyésztettük Marine Broth agaron egy éjszakán át 16 oC-on, másnap a hőkezelt mintákat 37 oC-on 1 órán át inkubáltuk. A sejteket 4000 RPM-en 20 percig centrifugáltuk, ezután kétszer átmostuk 50mM Trisz (pH: 8,8) oldattal, amit minden esetben centrifugálás (4000 RPM, 20 perc) követett. A baktérium sejtek lízisét 8 M karbamidot, 40 mM Triszt, 4% CHAPS-ot és 0,05% DNase I-t tartalmazó oldattal végeztük, majd 13200 RPM-en 20 percig centrifugáltuk. A felülúszó fehérje-tartalmát Bradford módszerrel határoztuk meg.
III. 2. 5. 2. Oldható fehérjetartalom mérése
A vizsgált mintáink oldható fehérje-tartalmát Bradford (1976) leírása szerint határoztuk meg, ami egy egyszerű, festékkötődésen alapuló, fehérje-tartalom mérésére szolgáló módszer, melynek elve szerint a Coomassie Brilliant Blue G-250 festék savas oldatának abszorbancia maximuma fehérje jelenlétében (mennyiségtől függően) 465 nm-ről 595 nm-re változik.
III. 2. 5. 3. Kétdimenziós gélelektroforézis
Az első dimenzióban a baktérium fehérjéket izoelektromos pontjuk alapján szeparáltuk immobilizált pH gradienst tartalmazó stripen. A mintákat rehidratáló pufferben oldottuk (8 M karbamid, 0,05% CHAPS, 25 mM DTT), majd 200 µg fehérjét vittünk fel a 17 cm-es stripekre, passzív rehidratálást (7 óra) követően Multiphor II system (Pharmacia) készüléken a gyártó által előírt program szerint fókuszáltuk. A molekulatömeg szerinti poliakrilamid gélben történő elválasztás előtt a stripeket equilibráltuk 6 M karbamidot, 2% SDS-t és 30% glicerolt tartalmazó Trisz-HCl pufferben (pH=8,8) első lépésben 1% DTT jelenlétében 10 percig, majd 5%
iodoacetamid jelenlétében szintén 10 percig. Második dimenzióban a fehérjéket 10% SDS-PAGE-n BIO-RAD PROTEAN II xi Cell készüléken szeparáltuk, 15 percig 20mA-en, majd 50mA-en.
Szeparáló gél (10%, 2 nagy gélre):
30% akrilamid/ bisz-akrilamid 29: 1 (Bio-Rad) 33,3 ml
1,5 M TRISZ-HCl (pH: 8,8) 25 ml
10% SDS 50 µl
Desztillált víz 40,2 ml
TEMED 33 µl
Ammónium-perszulfát (100 mg/ml) 500 µl
Fehérjedetektálás
- Coomassie Blue festéssel
A molekulatömeg szerinti elválasztás után a fehérjéket 20 percig fixáltuk 50% etanolt, 2%
foszforsavat tartalmazó oldatban. Coomassie Blue R-250-el (34% metanol, 3,5% foszforsav, 0,2%
Coomassie Blue R-250, 170g ammónium-szulfát) detektáltuk a fehérjéket. A gélt 30 percig rázattuk a festékoldatban, majd 30% metanol oldattal távolítottuk el a háttérben maradt felesleges festéket.
- Ezüstfestéssel
Az elektroforézis befejezése után a szeparált fehérjéket 20 percig fixáltuk 50% metanol/ 5 % ecetsav oldatban, majd pedig 10 percig 50% metanolban. A maradék fixáló eltávolításához 10 percig rázattuk a géleket desztillált vízben. Ezután 1 percig redukáltuk a fehérjéket 0,02% nátrium-tioszulfáttal, majd 20 percig inkubáltuk 4 oC-on 0,2% ezüst-nitrát festékoldatban. Desztillált vizes mosást követően 2% karnobátot, 0,05% formaldehidet (37%-os) és 0,0005% nátrium-tioszulfátot tartalmazó oldattal detektáltuk a fehérjéket. A reakciót 5% ecetsavval állítottuk le.
A gélképeket mindkét festési eljárást követően GS-800 denzitométer (BIO-RAD) készülékkel rögzítettük.
III. 2. 5. 4. Fehérjeazonosítás LC-MS/MS alkalmazásával
In situ emésztés
A gélből kivágott (manuálisan) mintákból első lépésben eltávolítottuk a Coomassie festéket, kétszer átmostuk 50 mM ammónium-bikarbonát/50% acetonitril oldattal (30 oC-on, 20 percig), majd levegőn szárítottuk. A fehérjék enzimes hidrolíziséhez tripszint használtunk. A mintákhoz 100 ng tripszint tartalmazó 8 µl puffert (50 mM ammmónium-bikarbonát) adtunk, elősegítve az enzim gélbe jutását, a mintákat jégen tároltuk 45 percig. A tripszines emésztést 37 oC-on végeztük egy éjszakán át további 50 mM ammmónium-bikarbonát hozzáadását követően. A peptideket 60%
acetonitril/1% hangyasav oldattal extraháltuk (30 oC-on, 3 percig), centrifugáltuk (13 200 RPM, néhány másodpercig) és fagyasztva szárítottuk.
LC-MS/MS
A proteolizátum fehérjemintáinak aminosav szekvenciáját LC/MS/MS technikával határoztuk meg. A mintákat 0,1% hangyasavban feloldva Ultimate Micro LC rendszeren (FAMOS automata mintaadagolóval) vizsgáltuk. A méréshez PEPMAP, 75 µm, 15 cm kolonnát ill. előkoncentráláshoz 800 µm, 2 mm kolonnát használtunk. Az eluálást lineáris gradiensen végeztük, az 5%
acetonitril/0,1% hangyasav kiindulási koncentrációt 30 perc alatt 80% acetonitril/0,1% hangyasavra növelve, 100 nl/perc áramlási sebesség mellett. Az oszlopról eluált peptidek egy nanoelektrospray tűn keresztül jutottak a Q-TOF tömegspektrométerbe (Micromass). Az MS/MS spektrumokat manuálisan értékeltük, az eredményként kapott aminosav szekvenciából az NCBI (National Centre of Biotechnology Information) adatbázis Blast algoritmusával (www.ncbi.nlm.nih.gov ill.
www.ebi.ac.uk) azonosítottuk a fehérjéket.
IV. CÉLKITŰZÉSEK
Munkám során proteomikai módszerek alkalmazásával a következő feladatokat végeztem el:
• Allergén búzafehérjék allergenitása és hidrofób jellege közötti összefüggés tanulmányozása 2-DE és MALDI-MS technika alkalmazásával. A köztermesztésbe vont kenyérgabona, a Hereward búza Osborne frakcióinak proteomikai tanulmányozása, és az albumin-globulin frakcióban megtalálható ismert búzaallergének jellemzése hidrofób jellegük szerint.
• Abiotikus (szárazság) stressz hatásának vizsgálata szülői és transzgénikus búza vonalak fehérjéinek összetételére és biológiai aktivitására. Stressz-indukált fehérjék kimutatása a szülői CY-45 és a transzgénikus T-117, T-106-3/a és T-128 búza vonalak tanulmányozásával.
• Különböző tavaszi árpa vonalak fehérje-összetételének vizsgálata és összehasonlítása azzal a céllal, hogy hogyan változnak szárazság-stressz hatására. A kísérletbe vont fajták (Scarlett, Jubilant, Pasadena, Mandolina) karbamid-oldható frakciójának fehérjetérképei szolgáltatják az összehasonlítás alapját.
• Egy tritikále (Marko) vonal fehérje-összetételének és biológiai aktivitás változásának nyomon követése az érési állapot függvényében, virágzás utáni 7., 14., 21. és 28. napon learatott gabonaszemek albumin-globulin frakciói alapján.
• 2-DE és LC-MS/MS technika alkalmazása hőstressz hatásának vizsgálata céljából, egy olyan organizmus (Shewanella hanedei) proteomikai tanulmányozására, amelynek genomja még nem feltérképezett.
V. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
V. 1. Hereward búza kétdimenziós fehérje-térképének elkészítése és a fehérjék azonosítása
A genomika információt szolgáltat a szervezet genetikai állományáról, míg a proteomika a fehérje-összetételről: ahhoz hogy megértsük a növények genomja által meghatározott genetikai információkat, szükségünk van a génexpresszió eredményeként szintetizálódott fehérjék azonosítására. Ennek technikai feltétele egy olyan módszer, ami lehetővé teszi nagyszámú fehérje elválasztását és azonosítását egyidőben. Angliában az egyik legelterjedtebb köztermesztésbe vont kenyérgabona, a Hereward búza proteomikai vizsgálatát végeztük el.
A búzafehérjék frakcionálása oldhatóságuk alapján még ma is elterjedt módszer, az egyes frakciók azonban nem különíthetők el élesen, gyakori a fehérjék átoldódása a frakciók között. A vizsgált magas fehérjetartalmú Hereward őszi búzából Osborne szerinti frakcionálással előállított fehérjefrakciók további elválasztását kétdimenziós elektroforézissel, a fehérjék azonosítását pedig MALDI-MS technikával végeztük.
V. 1. 1. Kétdimenziós elektroforézis és MALDI-MS technika alkalmazása só- és vízoldható búzafehérjék elválasztására és azonosítására
Hereward búza albumin-globulin frakció fehérjéit első dimenzióban pH: 3-10 ill. 6-11 tartományban izoelektromos fókuszálással szeparáltuk, majd a második dimenzióban a mintákat 10%-os SDS-PAGE futtatással molekulatömegük szerint választottuk el. A kétdimenziós gélen a vizsgált frakcióból mintegy 200-250 fehérjét detektáltunk 7–90 kDa molekulatömeg és 3–10 izoelektromos pont tartományban (4/a. ábra). A bázikus tulajdonsággal rendelkező fehérjék izoelektromos fókuszálásához pH: 6-11 tartományú stripet használva az elválasztás felbontását jelentősen megnöveltük (4/b. ábra).
4. ábra
Hereward búza albumin-globulin frakció fehérjéinek kétdimenziós elektroforetikus elválasztási képe (pH: 3-10 és 10-120 kDa ill. pH: 6-11 és 10-120 kDa tartományban)
Sypro Ruby-festést követően a fehérje foltokat kivágtuk a gélből (5. ábra), majd tripszines
Sypro Ruby-festést követően a fehérje foltokat kivágtuk a gélből (5. ábra), majd tripszines