Génexpressziós vizsgálatok

3.5.1. Az mRNS-szintek meghatározása direkt módszerekkel

3.5.1.1. RNS izolálás

Az egyes transzkriptumok mennyiségi összehasonlításához az össz-RNS minták tisztítását a Chomczynski és Sacchi (1987) módszere alapján kifejlesztett TRI-reagens (Sigma) felhasználásával végeztük a gyártó útmutatása szerint. Ennek során 1 g növényi anyagot folyékony nitrogénben homogenizáltunk, majd 10 ml TRI-reagensben szuszpendáltunk. Az extrakciót és particionáltatást követően a vizes fázisban maradó RNS-t izopropanollal kicsaptuk, centrifugálással összegyűjtöttük, etanollal sómentesre mostuk és megszárítottuk. Az RNáz-mentes vízben visszaoldott mintákat OD260-as abszorpciójuk alapján egységesen 2 mg/ml koncentrációra állítottuk be, és felhasználásig -20ºC-on tároltuk.

3.5.1.2. Northern-blot hibridizáció

Northern-blot analízis során mintánként 20-20 µg RNS-t denaturáltunk, majd formaldehid tartalmú 1%-os agaróz gélen történt elektroforézissel frakcionáltunk. A gélek rövid etidium-bromidos festése után a 275 nm-es UV fényben fluoreszkáló RNS mintázatról fényképet készítettünk. Ezután a gélből az RNS-eket 20x SSC pufferben végzett kapilláris transzferrel Nytran N hibridizációs membránra (Schleicher & Schuell) kötöttük, majd 275 nm-es UV kezeléssel rögzítettük.

A hibridizációs próbát a megfelelő cDNS fragmentumból (20 ng) állítottuk elő Megaprime (Amersham) jelölő kit és [α-³²P]dCTP felhasználásával. A membránhoz kötött RNS hibridizációját Church-pufferben (Church és Gilbert, 1984) végeztük 68ºC-on, majd stringens mosás után a membránon maradt radioaktív hibridizációs jeleket Phosphoimager 445 SI (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) készülék segítségével detektáltuk és értékeltük.

3.5.1.3. Reverz-transzkripcióval kapcsolt PCR analízis

Az mRNS-szintek szemikvantitatív, reverz-transzkripcióval kapcsolt PCR (RT-PCR) módszerrel történő összehasonlításához 5 µg RNS mintából oligo-dT primer segítségével cDNS-t szintetizáltuk Ready-to-Go (Pharmacia Biotech) első szál szintézis kit segítségével. A PCR reakciókat a kapott cDNS 10%-ával végeztük olyan primerek felhasználásával, amelyek a vizsgált gének kódoló szakaszának 3' végéhez közeli, 250-350 bp-nyi terméket amplifikáltak. Az alkalmazott ciklusszámot a PCR

_____________________________________________________________________

3. táblázat: Az RT-PCR analíziseknél felhasznált fontosabb génspecifikus primerek _____________________________________________________________________

reakciók exponenciális tartományán belül az egyes transzkriptumok gyakoriságának megfelelően optimalizáltuk. Az ideálisan alacsony ciklusszám és a pontosabb értékelhetőség érdekében esetenként a reakciókhoz jelölőként [α-³²P]-dCTP-t adtunk, és a termékeket autoradiográfiával detektáltuk. Az vizsgált gének és a konstitutív kontrollként használt Arabidsopis POLIUBIQUITIN 10 (UBQ10), ill. paradicsom Actin specifikus primereinek szekvenciái a 3. táblázatban láthatók.

3.5.2. Promóter-aktivitás vizsgálata riportergének segítségével

3.5.2.1. β-Glukuronidáz-alapú analízisek

A transzgenikus növényekben a β-glukuronidáz (GUS) aktivitás hisztokémiai detektálását Jefferson (1987) módszerével végeztük. A mintavételt követő hatások kiküszöbölésére a növényeket a Puente és mtsai (1996) által leírtak szerint 2%-os formaldehid oldatban 10 percig fixáltuk. A GUS reakcióelegybe helyezett mintáknál az 5-bromo-4-kloro-indolil-β-D-glukuronid (X-gluc) szubsztrát felvételét 10 másodperces vákuum-infiltrációval segítettük elő, majd az ezt követő hisztokémiai festést 12 órán át sötétben, 37°C-on végeztük. A reakcióelegy eltávolítása után a képződött indigó színezéket a növényi pigmentek 50%-os etanollal történt eltávolításával tettük láthatóvá.

A GUS aktivitások kvantitatív összehasonlítását a Jefferson (1987) által kifejlesztett spektrofluorimetriás módszerrel végeztük. A kivonó pufferben homogenizált növények sejtmentes felülúszóiból vett mintákat össz-protein tartalom alapján azonos koncentrációra állítottuk be, és szükség esetén felhasználásukig -80°C-on tároltuk. A mérések során a nagy tisztaságú 4-metil-umbelliferil-β-D-glukuronid szubsztrátból (Sigma) keletkező fluoreszcens termék mennyiségét 4-metil-umbelliferon standard segítségével, Quanta Master QM-1 spektrofluoriméterrel (Photon Technology, Inc., Birmingham, NJ, USA) határoztuk meg.

3.5.2.2. Luciferáz-alapú vizsgálatok

Kísérleteinkhez egyhetes, LUC riportergént hordozó transzgenikus csíranövényeket használtunk fel. A csíranövényekből 100-100-at kompakt csoportokat kialakítva friss táptalajra helyeztünk, majd ezeket a mérés kezdete előtt 36 és 24 órával steril, 25 mM-os D-luciferin (Biosynth A.G., Staad, Svájc) oldattal permeteztük. A

mérések a csíráztatás utáni 8. napon, a fényszakasz végén kezdődtek, ami konstans (LL, ill. DD) fényviszonyok mellett a ZT 12 időpontnak (ZT: „zeitgeber time”, az utolsó fényperiódus kezdetétől eltelt idő) felelt meg.

Az in vivo lumineszcencia méréseket folyékony nitrogénnel hűtött, nagy érzékenységű CCD („charge-coupled device”) kamerával (LN-CCD-512-TKB, Princeton Instruments, Trenton, NJ, USA), a Millar és munkatársai (1992a) által kidolgozott módszerrel végeztük. Az egyes növénymintákról kétóránként 25 perces digitális felvételeket készítettünk, majd az így rögzített lumineszcenciát Metamorph program (Meta 4.5 programcsomag, Universal Imaging) segítségével integráltuk. A - főként fotoszintetikus pigmentektől eredő - késleltetett fluoreszcencia kiküszöbölése érdekében a mintákat már öt perccel az expozíciók kezdete előtt sötétbe helyeztük. A mért fotonszámot a kamera hátterével korrigáltuk, és az így kapott értékeket az idő függvényében ábrázoltuk. Az egyes méréseket legalább négy alkalommal ismételtünk.

A párhuzamos eredmények nem mutattak jelentős szórást, ezért az összehasonlításoknál ezekből rendre egy-egy reprezentatív adatsort használtunk fel.

3.6. „Differential display” mRNS analízis

A BR kezelés hatására bekövetkező mRNS-szint változások detektálására ún.

differential display (DD RT-PCR) analízist (Liang és Pardee, 1992) végeztünk az RNAimage (GenHunter Corp., Nashville, TN, USA) rendszer felhasználásával, a gyártó által javasolt módszer szerint. Egyhetes csíranövényeket 2 órán át kezeltünk 100 nM BL-dal, 100 µM cikloheximid jelenlétében. A növény anyagból izolált RNS minták esetleges DNS szennyeződését RNáz-mentes DN-áz I (Boehringer) segítségével távolítottuk el. Az egyes RNS preparátumok 0,2 µg-nyi mennyiségeivel három párhuzamos reakcióban, 3'-végükön eltérő nukleotidát tartalmazó oligo-dT primerek felhasználásával cDNS-t szintetizáltunk. A kapott termékek 10%-ának felhasználásával PCR reakciót végeztünk, melyben az eredeti oligo-dT és egy optimalizált, 13 nukleotidányi primer segítségével diszkrét méretű, ³²P jelölést hordozó DNS szakaszokat amplifikáltunk. Denaturáló poliakrilamid gélen történt frakcionálást követően az autoradiográfiával azonosított, eltérő abundanciájú transzkriptumoknak megfelelő PCR termékeket izoláltuk. Ezeket az eredeti primerekkel újra amplifikáltuk, majd megfelelő tisztítás után sorrendjüket meghatároztuk. A nukleotida-szekvenciák homológiája alapján azonosított mRNS-ek szintjének BR-szabályozottságát Northern-hibridizációval ellenőriztük.