Az előállított vegyületek in vitro sejtosztódás gátlási vizsgálatait az SZTE Gyógyszerhatástani és Biofarmáciai Intézetében végezték el. A mérések több, különböző humán ráksejtvonalon (emlőrák adenocarcinoma: MCF7, T47D, MDA-MB-231 és MDA-MB-361; méhnyakrák adenocarcinoma: HeLa,C33A, SiHa) 10 μM, és 30 μM koncentrációban történtek, MTT assay segítségével.170
Az 5α-androsztánváz A- és D-gyűrűjéhez 1α,2α- (6a–g, 13a, 13b, 13d–g) és 15β,16β-helyzetben kondenzált izoxazolinok (8a–e, 15a–e) esetében a farmakológiai hatásvizsgálatokat emlőrák sejtvonalakon végezték. Mivel korábban az izoxazolin gyűrűt hordozó szteroid-származékokról kimutatták,171 hogy különböző nőgyógyászati ráksejtvonalakon in vitro sejtosztódást gátló hatást fejtenek ki, az együttműködő partnereink a proliferációgátlás meghatározására irányuló előzetes kísérleteket végeztek. Várakozásainkkal ellentétben azonban már a vizsgálatok korai fázisában kiderült, hogy a vegyületek inaktívak, és sejtosztódás gátló hatásuk jócskán alulmaradt a referenciaként alkalmazott ciszplatinéhoz képest.
59. ábra: A pregnánváz D-gyűrűjéhez 16α,17α-helyzetben kondenzált izoxazolinok (10a–e és 17a–e) in vitro sejtosztódás gátlási vizsgálatainak eredményei
Egy rokon vegyületcsoport, a pregnánváz D-gyűrűjéhez 16α,17α-helyzetben kondenzált izoxazolinok 3β-OH származékai (17a–e) mutattak ugyan valamekkora proliferációgátló hatást, ám főként a magasabb, 30 M-os koncentráció tartományban. A 3β-acetoxi analogonjaik (10a–e) kisebb aktivitással bírtak (59. ábra). A 3β-OH vegyületek (17a–e) közül a p-klórfenil- (17b), a p-nitrofenil- (17c) és a p-tolil-származékok (17e) a szubsztituenst nem tartalmazó fenilszármazékhoz (17a) képest nagyobb sejtosztódás gátlással rendelkeztek, míg a p-metoxifenil analogon (17d) igen kismértékű aktivitással bírt.
Az 1,3-dipoláris cikloaddícióval előállított, D-gyűrűhöz kondenzált heterociklusok (25a–k, 26a–k, 27f és 28f) in vitro farmakológiai vizsgálatai négyféle emlőrák sejtvonalon (MCF7, T47D, MDA-MB-231 és MDA-MB-361) történtek (60. ábra). Az arilpirazolinok között a dezacetilezéssel nyert 3β-OH analogonok (26a–k, 28f) a 3β-OAc származékokhoz (25a–k, 27f) képest erőteljesebb gátló hatást gyakoroltak a ráksejtek osztódására. A vegyületek egyes sejtek proliferációjára kifejtett gátlását a fenilgyűrű szubsztituenseinek jellege jelentős mértékben befolyásolta. Ennek megfelelően az aromás gyűrűjükön p-CH3 (26d), p-F (26g), p-Cl (26h) és p-CN (26j) csoportot tartalmazó anyagok erőteljesebb, míg az o-CH3
(26b), m-CH3 (26c) és o,p-diCH3 (26e) funkciókkal bíró származékok csökkent aktivitással bírtak. A halogénezett vegyületek (26g–i) esetében az aktivitások általában a szubsztituens méretének növekedésével, a F > Cl > Br sorrendben csökkentek. A p-OMe csoport jelenléte a 27f pirazol analogon aromás csoportján előnyösnek bizonyult, míg a p-metoxifenil-pirazolin (26f) szerényebb hatással rendelkezett. A legígéretesebb aktivitást mutató vegyületeket (10 μM-nál a ráksejtek növekedésének legalább 50%-os gátlása) további vizsgálatoknak vetették alá, és meghatározták azok IC50-értékeit. A p-nitrofenil (26k) származék meglehetősen alacsony IC50-értékkel rendelkezett három sejtvonal esetén is (0,94–1,45 μM), azonban a sejtosztódásra kifejtett inhibíciója még 30 μM-os koncentrációban sem haladta meg a ~70%-ot.
A vizsgált származékok közül négy pirazolin és egy pirazol vegyület (26d, 26g, 26h, 26j és 27f) kiemelkedő, koncentrációfüggő antiproliferatív aktivitást mutatott mind a négy sejtvonalon, és dózis-hatás görbéjük alapján meghatározott IC50-értékeik a referenciaként alkalmazott ciszplatinnál kisebb vagy azzal összemérhetőnek adódtak (60. ábra).
A beépített fenilgyűrű funkciós csoportjainak minősége és az androsztánváz 3β szubsztituensének jellege jelentős befolyást gyakorolt a biológiai hatásra. A bemutatott eredmények azt sugallják, hogy az ilyen típusú, az androsztánváz D-gyűrűjéhez kondenzált aril-pirazolinok ígéretes szerkezetnek tekinthetők az új rákellenes vezérmolekulák megtervezéséhez és szintéziséhez. A farmakológiai vizsgálatok eredményeit összefoglaló szerkezet-hatás összefüggések a 61. ábrán láthatók.
25, 26 R1 R2 R3
60. ábra: Az androsztánváz D-gyűrűjéhez kondenzált heterociklusos származékok (25a–k, 26a–k, 27f és 28f) in vitro sejtosztódás gátlási vizsgálatainak eredményei
61. ábra: Szerkezet-hatás összefüggések, valamint a leghatékonyabb N,N-heterociklusos származékok dózis-hatás görbéi és IC50 értékei
Vegyület IC50 [M]
MCF7
T47D
MDA-MB-231
MDA-MB-361
26d 6,99 4,55 6,73 5,38
26h 8,64 5,66 7,72 8,49
26j 4,05 3,78 5,07 3,56
26g 4,73 5,43 4,00 4,03
27f 9,32 8,40 5,71 7,77
ciszplatin 5,78 9,78 19,13 3,74
26d 26g
26h 26j
27f
Az androsztánváz D-gyűrűjéhez 16α,17α-helyzetben kondenzált pirazolinokat (31a, 31d–k, 36 és 37) is in vitro farmakológiai vizsgálatoknak vetették alá, hogy megállapítsák antiproliferatív aktivitásaikat négyféle emlőrák sejtvonalon (MCF7, T47D, MDA-MB-231 és MDA-MB-361) (62. ábra) és háromféle méhnyakrák sejtvonalon (HeLa, C33A, SiHA) (63. ábra). Annak ellenére, hogy több különböző eredetű humán ráksejtvonalon már számos, korábban szintetizált, D-gyűrűhöz kondenzált androsztánvázas arilpirazolin figyelemre méltó osztódás gátló hatással rendelkezett,139–141 a vizsgálat tárgyát képező vegyületek (31a, 31d–k, 36 és 37) csak mérsékelt aktivitással bírtak. A 37-es N-metil-szubsztituált származék bizonyult a leghatékonyabbnak, IC50-értéke 3,7 μM-nak adódott MDA-MB-361 emlő ráksejtvonal esetén (62. ábra), és 10,6 μM-nak HeLa méhnyakrák sejtvonalon (63. ábra). Ezek az eredmények a klinikai gyakorlatban használt ciszplatin IC50-értékeivel összemérhetőek. A többi vegyület az alkalmazott ráksejtvonalakon kevésbé volt aktív, és azok – függetlenül a pirazolin gyűrű szubsztituenseitől – csak 30 μM-os koncentráció tartományban mutattak antiproliferatív hatást.
Ennek alapján kijelenthető, hogy nemcsak a pirazolin gyűrű szubsztituenseinek természete, hanem a heterogyűrű szteránvázhoz való kapcsolódásának a módja, és így a teljes molekula térbeli struktúrája, továbbá a C=N kettős kötés helyzete is kulcsfontosságú hatással van a farmakológiai aktivitásra.
Összességében az in vitro farmakológiai vizsgálatok eredményei alapján megállapítható, hogy a pirazolin molekularész az izoxazolin gyűrűvel szemben ígéretesebb szerkezeti elemnek bizonyult a vizsgált nőgyógyászati ráksejtvonalak szempontjából. Függetlenül a vázhoz való kapcsolódási helyüktől, módjuktól és a heterogyűrűn lévő szubsztituensek jellegétől, az izoxazolin származékok egy esettől eltekintve inaktívnak bizonyultak. A szintén nagy szerkezeti diverzitást mutató öttagú N,N-heterociklusok között azonban jó néhány pirazolin (26d, 26g, 26h, 26j) és egy pirazol (27f) is említésre méltó sejtosztódás gátló hatást mutatott.
Az ösztránváz D-gyűrűjéhez 16α,17α-helyzetben kondenzált pirazolinok (48a, 48b, 48d–k), és az 5α-androsztánváz A-gyűrűjéhez 2,3-helyzetben kondenzált pirazolok (51a, 51b, 51d–k és 52a, 52b, 52d–k) in vitro sejtosztódás gátlási vizsgálatai jelenleg is folyamatban vannak.
R1 R2
62. ábra: Az androsztánváz D-gyűrűjéhez 16α,17α-helyzetben kondenzált pirazolinok (31a, 31d–k, 36 és 37) in vitro sejtosztódás gátlási vizsgálatainak eredményei emlőrák
sejtvonalakon
R1 R2
63. ábra: Az androsztánváz D-gyűrűjéhez 16α,17α-helyzetben kondenzált pirazolinok (31a, 31d–k, 36 és 37) in vitro sejtosztódás gátlási vizsgálatainak eredményei méhnyakrák
sejtvonalakon