N EUROPEPTID ÉS RECEPTOR M RNS MEGOSZLÁSÁNAK VIZSGÁLATA A HUMÁN GANGLION CERVICALE

3.3.1. Háttér

A sympathicus idegrendszerből származó rostok a SCG-on át idegzik be a cerebrális vasculaturát (Nielsen and Owman 1967). Az a. basilaris és az a. vertebralis ágait a ganglion stellatumból eredő rostok is ellátják (Arbab et al. 1988). A corticális felszín kicsiny piális noradrenalin (NA)-tartalmú idegi elemei a locus ceruleusból (LC) és/vagy a hypothalamusból származnak (Duverger et al. 1987; Owman and Edvinsson 1977). A sympathicus rendszer transzmitterei a NA (Edvinsson et al. 1976), a NPY (Edvinsson et al. 1983) és az adenozin trifoszfát (ATP) (Edvinsson 1996; Edvinsson et al. 1993). A rendszer aktivációja vasoconstrictiót, a cerebrovascularis autoreguláció megváltozását, az intrakraniális nyomás-, a cerebrális vérvolumen- és a CSF termelődés változását idézi elő (Edvinsson and Krause 2002). A fenti reakciók elsősorban NA és NPY hatásaként következnek be (Raichle et al.

1975; Hartman et al. 1980; Goadsby et al. 1982; Edvinsson et al. 1983; Edvinsson et al. 1984;

Goadsby et al. 1989). Humán tekintetben igen kevés immunhisztokémiai vizsgálata történt a SCG-nak. Ezen munkákból felkeltették érdeklődésünket Baffi és munkatársainak eredményei, akik a humán SCG-ban a parasympathicus marker, a VIP jelenlétét igazolták (Baffi et al.

1992). Különös tekintettel arra, hogy korábbi TRIG-ben végzett vizsgálataink mind VIP1, mind NPY Y1 és NPY Y2 receptorok jelenlétére utaltak (Tajti et al. 1999/a) és ismert volt, hogy egyes migrénes páciensek fejfájásos rohama során az autonóm rendszer aktivitását tükröző klinikai tünetek is megjelentek (Goadsby e al. 1990), így felmerült az SCG vizsgálatának a szükségessége. Tovább erősítette szándékunkat az a megfigyelés, hogy aurával járó fiatal migrénes betegek vérplazmájában roham alatt emelkedett NPY koncentrációt találtak, míg fejfájásmentes időszakban ez csökkent (Gallai et al. 1994).

Ugyanakkor migrénes roham során suboccipitalisan nyert CSF elemzése nem változó NPY koncentrációt mutatott (Vécsei et al. 1992). Ezért célul tűztük ki a SCG feltérképezését sympathicus és parasympathicus rendszerre jellemző neuropeptidek és receptoraik irányába (Tajti et al. 1999/b).

3.3.2. Anyag és módszer

Vizsgálataink során post-mortem humán SCG-ból készült preparátumokon immunhisztokémiai és RT-PCR technikákat alkalmaztunk. Részletes leírást lásd az 5.1.

fejezetben.

3.3.3. Eredmények

Neuropeptid és receptor mRNS előfordulása a humán SCG-ban.

Immunhisztokémia

A SCG neuronjainak 80%-a NPY-ir-t, 75%-a vesicula monoamin transzporter (VMAT)-ir-t, 75%-a tyrozin hydroxyláz (TH)-ir-t, 3%-a VIP-ir-t mutatott, míg NOS-ir, CGRP-ir és SP-ir nem voltak megfigyelhetők. A sejttestek 40%-a HO-2-ir-t adott. A NPY-ir neuronok mindegyike TH-ir volt, míg a TH-ir sejtek 50%-a adott NPY-ir-t (3. táblázat) (34. ábra A, B, C, D).

3. táblázat. A humán ganglion cervicale superius (SCG) immunreaktív neuronjainak százalékos megoszlása

Neuropeptid Immunreaktív neuronok százalékos megoszlása (%)

NPY (C-PON) 80

VMAT 75

TH 75

HO-2 40

VIP 3

NOS 0

CGRP 0

SP 0

Rövidítések: CGRP: calcitonin génnel-rokon peptid, C-PON: neuropeptid Y C-terminális flanking peptidje, HO-2: hem-oxigenáz-2, NOS: nitrogén-oxid-szintetáz, NPY: neuropeptid Y, SCG: ganglion cervicale superius, SP:

P-anyag, TH: tyrozin hydroxyláz, VIP: vasoactiv intestinalis polipeptid, VMAT: vesicula monoamin transzporter

34. ábra (A, B, C, D). Az Immunfluoreszcens reakciók vesicula monoamin transzporter (VMAT) tyrozin hydroxyláz (TH), vasoactiv intestinalis polipeptid (VIP), neuropeptid

Y C-terminális flanking peptidje (C-PON) a humán ganglion cervicale superiusban (SCG)

Számos sejttest mutatott VMAT- (A)-ir-t és, TH (C) -ir-t, jóval kevesebb számban mutattak a sejtek VIP (B) -ir-t. C-PON-ir sejttestek és varicosus idegrostok láthatók a (D) képen (250x-es nagyítás).

Rövidítések: C-PON: neuropeptid Y C-terminális flanking peptidje, SCG: ganglion cervicale superius, TH:

tyrozin hydroxyláz, VIP: vasoactiv intestinalis polipeptid, VMAT: vesicula monoamin transzporter

Receptor mRNS analízis (RT-PCR, agaróz gél elektroforézis)

A SCG RT-PCR termékének agaróz gél elektoforézise alapján NPY Y1 (563 bp), NPY Y2

(718 bp) és VPAC1 (269 bp) receptor mRNS jelenléte volt kimutatható, míg CGRP1 receptor mRNS nem volt detektálható (35. ábra a, b).

35. ábra (a, b). Neuropeptid receptor a neuropeptid Y Y1 (NPY Y1), a neuropeptid Y Y2

(NPY Y2) és VPAC1 mRNS analízis a humán ganglion cervicale superiusban (SCG) Az RT-PCR termék gél elektroforézise jelezte a humán NPY Y₁ (1. oszlop, 563 bp) és a VPAC1 (2. oszlop, 269 bp) jelenlétét, míg a CGRP1 receptorra utaló szignált nem találtunk a SCG-ban (3. oszlop) (a). A humán NPY Y2 receptor (1. oszlop, 718 bp) (b) jelenléte is megfigyelhető volt. Negatív kontrollként , amikor a reverz transzkriptáz fázis el lett hagyva, amplifikációs produktum nem jelent meg („B” oszlop). Promega 100 bp DNS (Promega, SDS, Svédország) volt futtatva a pontos molekuláris nagyság meghatározása céljából („M”

oszlop).

Rövidítések: mRNS: hírvivő ribonukleinsav, NPY Y1: neuropeptid Y Y₁ receptor, NPY Y₂: neuropeptid Y Y₂ receptor, SCG: ganglion cervicale superius, VPAC₁: VIP₁ vagy PACAP₂ receptor

3.3.4. Megfigyeléseink jelentősége

• Eredményeink támogatták azon megfigyeléseket, miszerint az életkor változása és a NPY-ir neuronok előfordulásának gyakorisága a SCG-ban függ a speciestől. Patkányban az életkor növekedésével az SCG-ban a NPY tartalmú neuronoknak szelektív csökkenését állapították meg (Burnstock 1990). Vizsgálataink során idős elhunyt személyekből származó SCG sejteket vizsgáltunk, melyekben gazdag NPY-ir-t találtunk, ez egybecseng Jarvi és Pelto-Huikko korábbi megfigyeléseivel (Jarvi and Pelto-Huikko 1990). Patkányban a cerebrális ereket ellátó idegrostokban a VIP- és a CGRP aktivitás párhuzamosan növekedett

• Vizsgálataink során NPY Y1 és NPY Y2 receptor mRNS előfordulását írtuk le humán SCG-ban. A sympathicus idegvégződésekben a NPY ko-lokalizálódik a NA-nal a nagy

„dense-core” vezikulumokban és magas frekvenciájú intermittáló idegingerlésre felszabadul (Lundberg et al. 1986). A nyugalmi periódusban csak kicsiny mértékű a NPY felszabadulása, a sympathicus vazokonstrikció nagymértékben az adrenerg receptor aktivációtól függ, ugyanakkor erőteljes sympathicus aktivitásnál a NPY hozzájárulása prominenssé válik (Lundberg et al., 1986). A NA és a NPY számos hatással rendelkezik az erekben a sympathicus neuroeffektor junkcióban. Vazokonstrikciót okoznak, valamint azzal, hogy prejunkcionálisan gátolják a NA felszabadulást a NPY Y₂ és az adrenerg receptorok útján, így befolyásolják a neurotranszmitter felhasználást (Wahlestedt and Reis 1993). A NPY keringésre kifejtett hatását legalább két receptor fajtán át fejti ki: az Y₁ alcsoport feltételezhetően a fő posztjunkcionális receptorféleség a sympathicus vascularis neuroeffektor junkcióban, és megtalálták mind a vascularis simaizom- mind az endothel sejtekben, ahol mediálja a NPY kiváltotta perifériás vascularis rezisztencia növelését. Az Y2

receptor főként pre-synapticusan helyezkedik el, de szintén megfigyelték posztjunkcionális megjelenését is (Wahlestedt and Reis, 1993).

• A sympathicus rendszer meghatározó elemében, a SCG-ban, a parasympathicus marker a VIP neuronális megjelenését és a VIP1 receptor mRNS jelenlétét igazoltuk. Ez felvetette az autonóm egységek egymásra hatásának a lehetőségét.

A nyálban az α-amiláz jelenléte indirekt jele a sympathico-adrenomedullaris rendszer működésének. Az α-amiláz koncentrációja migrénes rohamban alacsonyabb, közvetlenül rohamot követően viszont magasabb volt, mint a kontroll csoportban, a fájdalommentes időszakban pedig megegyezett a kontrolléval. Ezen eredmények és a fejfájásroham során a CSF-ban észlelt NPY-ir emelkedés (64%-kal magasabb a kontroll csoporthoz képest) a sympathicus rendszer aktivitásának dinamikus változását igazolta migrénben (Bugdayci et al.

2010).

3.4. Neuropeptid és receptor mRNS megoszlásának vizsgálata humán ganglion