Enzim működését befolyásoló tényezők

Az enzimek felhasználhatósága szempontjából fontos információ az enzimek működését befolyásoló környezeti tényezők pontos ismerete. Ezen tényezők a hőmérséklet, kémhatás, ionok hatása, hőstabilitás, amelyeknek a pontos feltérképezése elengedhetetlen. Nehézséget jelent, hogy az eltérő forrásból származó enzimek más és más optimális környezetet igényelnek működésükhöz.

Hőmérséklet, pH és stabilitás

A két legfontosabb tényező, amelyek hatást gyakorolnak az enzimek működésére a hőmérséklet és a kémhatás. A hőmérséklet befolyása a biokatalízisnél két hatás eredőjeként nyilvánul meg, növelése egyrészt gyorsítja a kémiai reakciók sebességét, illetve az enzimek fehérje jellegükből adódóan magasabb hőmérsékleten szerkezetük megváltozik, majd denaturálódnak, így alkalmatlanná válnak a biokémiai folyamatok katalízisére. A hőmérséklet optimum meghatározása lényeges az enzim alkalmazhatósága szempontjából. A hőmérséklet optimum megállapítása mellett célszerű az adott tartományban az enzim stabilitását is megvizsgálni.

Különböző eredetű enzimek eltérő optimális hőmérséklettel rendelkeznek. A 11. táblázatban a mikroba eredetű -galaktozidáz enzimek működésének optimális hőmérséklet és pH értékeiket gyűjtöttem össze.

A felsorolt prokarióta eredetű -galaktozidáz enzimek közül a legnagyobb hőmérséklet optimummal a Bacillus stearothermophilus enzime rendelkezik. A Lactobacillus fajok által szintetizált enzimek 45-50 °C körüli optimummal rendelkeznek, de a L. curvatus R08 törzs eredetű enzim hőmérséklet optimuma csupán 37 °C volt [Yoon-Hwang, 2008]. Jól látható, hogy a mikroorganizmusok diverzitásának köszönhetően még az azonos fajból származó törzsek enzimeinek hőmérséklet optimuma is eltérő lehet. Például a L. fermentum CRL 722 jelű törzsnél ez az érték 50 °C, míg a CRL 251 jelű törzsnél 45 °C. Az eukarióta eredetű -galaktozidáz enzimek esetében megállapítható, hogy általában 50-55 °C tartományban található a hőmérséklet optimum, de 65 °C-ot is detektáltak termofil gombáknál.

A kémhatás tekintetében elmondható, hogy a bakteriális eredetű -galaktozidáz enzimek gyengén savas és semleges vagy esetleg gyengén lúgos kémhatáson mutatnak maximális aktivitást. A tejsavbaktériumoknál tapasztalták a legalacsonyabb pH optimumot (pH=4,5), amely a nemzetség sajátosságából adódik. A gomba eredetű enzimek esetében egyértelműen a savas kémhatás volt kedvező az enzim működése szempontjából. A legalacsonyabb pH=3,0 optimumot a Penicillium oxalicum törzsből származó enzimnél tapasztalták.

11. táblázat Mikrobiális -galaktozidáz enzimek optimális pH és hőmérséklet adatai

Bifidobacterium breve 203 5,5-6,5 Xiao et al., 2000 Bifidobacterium breve 203 5,5 50°C Zhao et al., 2008 Lactobacillus curvatus R08 6,5-7,0 37 °C Yoon & Hwang 2008 Lactobacillus fermentum Lactobacillus reuteri 4,5-5,0 50 °C Tzortzis et al., 2003 Leuconostoc mesenteriodes

JK55

8,0-8,5 37 °C Yoon & Hwang 2008 Streptomyces sp. S27 7,4 35 °C Cao et al., 2010 Streptomyces griseoloalbus 6,0 30 °C Anisha et al., 2007

Eukarióta eredetű

Aspergillus niger 4,5-5,0 Scigelova & Crout, 2000 Aspergillus niger N400 4,5 50-55°C Manzanares et al., 1998 Aspergillus oryzae 4,8 50 °C Prashnath & Mulimani

2004 Aspergillus parasiticus

MTCC-2796

5,0 50 °C Shivam & Mishra, 2010 Gibberella fujikuroi 5,8 56 °C Thippeswamy &

Mulimani 2002 Penicillium oxalicum SO 3,0 60 °C Kurakake et al., 2011 Thermomyces lanuginosus

Számos kísérletben egy meghatározott hőmérsékleten vagy pH-n vizsgálták az enzim stabilitását megadott időtartamig és adták meg a kezdeti aktivitáshoz képest megmaradt aktivitást százalékosan [Carrera-Silva et al., 2006, Manzanares et al., 1998]. A másik lehetséges megközelítés, hogy a felezési időt határozzák meg különböző környezeti feltételek mellett [Gote et al., 2004, Puchart et al., 2000, Shivam & Mishra, 2010]. Összehasonlíthatóság és alkalmazástechnikai szempontból véleményem szerint a felezési idő informatívabb.

12. táblázat Különböző eredetű -galaktozidáz enzimek stabilitásra vonatkozó adatai

EREDET -galaktozidáz Stabilitás Hivatkozás

Aspergillus niger

extracelluláris 55 °C 120 perc Patil et al., 2010 Bacillus

intracelluláris 60 °C 10 perc Tzortzis et al., 2003

L. curvatus R08 intracelluláris t_1/2 → 37°C, 1 óra Yoon-Hwang, 2008

A hőmérséklet és kémhatás mellett az aktivátoroknak és inhibitoroknak is fontos szerepe van az enzim működése szempontjából. Ilyen jellegű vizsgálatok esetében fontos az adott ionok, vegyületek koncentrációját figyelembe venni.

A szulfhidrilreaktív ionok, mint az ezüst és a higany teljes gátló hatást fejtenek ki az -galaktozidáz enzimre. Ennek oka az lehet, hogy az enzim katalitikus régiójában tiol csoportot tartalmazó aminosav áll, és az említett ionok ezen aminosavak funkciós csoportjához kötődhetnek és így lecsökkentik az enzim aktivitását. A Hg²⁺ és Ag²⁺ enzim inaktiváló hatásairól számos szakirodalom beszámolt [Gote et al., 2006; Carerra-Silva et al., 2006; Xiao et al., 2000;

Shivam & Mishra, 2010]. Cao és munkatársai [2010] is vizsgálták az E. coli törzsbe klónozott Streptomyces sp. S27 törzs -galaktozidáz enzimét és arra a megállapításra jutottak, hogy az ezüst és a higany ionok (1 és 5 mM koncentrációban) teljesen gátlólják az enzimet. Hasonló

eredményeket tapasztaltak Patil és munkatársai [2010] a Bacillus megaterium VH1 törzs -galaktozidáz enzimének vizsgálatakor. 1 mM koncentrációjú Ag²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺ ionok erős inhibitorok voltak. Egy másik Bacillus faj tisztított -galaktozidáz enziménél 1 mM-os koncentrációban gátló hatást fejtett ki az Ag²⁺, Hg²⁺ mellett a Cu²⁺ ion is. Az -galaktozidáz enzim tiol csoportja mellett karboxil csoportok is megtalálhatók az aktív centrumban [Gote et al., 2006]. A Cu²⁺ ion gátló hatásáról Ibrahim és munkatársai [2010] is beszámoltak hat Lactobacillus reuteri törzs -galaktozidáz enzim esetében.

A Cr³⁺, Ni⁺, illetve Zn²⁺ ionok (1 és 5mM koncentráció) gátló hatásáról számoltak be Streptomyces sp. S27 törzs -galaktozidáz génjének klónózását követően [Cao et al., 2010]. Míg egy Bacillus faj alfa-galaktozidáz enzimére nem fejtett ki sem gátló sem aktiváló hatást az 1 mM koncentrációjú Ni²⁺ illetve Zn²⁺ ion sem [Gote et al., 2006]. Más ionok, mint a Ba²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Fe³⁺, K⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺ (1mM), illetve az EDTA (10mM), a -merkaptoetanol (1 mM) és az urea (1mM) nem befolyásolták az enzim működését, aktivitását.

Az Aspergillus parasiticus MTCC-2796 törzs enzim aktivitását 17,5, illetve 12%-kal növelik 1mM Ca²⁺ és K⁺ ionok [Shivam & Mishra, 2010].

A szénhidrátok is befolyásolhatják az enzim működését. Különböző szerkezetű szénhidrátok hatását egy Bacillus faj alfa-galaktozidáz enzimére vizsgálták Gote és munkatársai [2006], és megállapították, hogy a galaktóz, melibióz, sztachióz inhibitorként szolgáltak, míg a glükóz, fruktóz, szacharóz nem gátolták az enzimet. A galaktóz gátló hatását más mikroorganizmusok (mint például Aspergillus parasiticus) esetében is tapasztalták [Shivam & Mishra, 2010].

Proteáz enzimek közül a semleges proteázok, mint az -kimotripszin, szubtilizin A, kollagenáz nem voltak hatással a Streptomyces sp. S27 törzs -galaktozidáz enzim aktivitására [Cao et al., 2010].