A poli(szukcinimid)-et L-aszparaginsav termikus polikondenzációjával állítottam elő magas hőmérsékleten és alacsony nyomáson (7. ábra).
7. ábra: A poli(szukcinimid) szintézise.
A reakcióhoz 20 g o-foszforsavat és 20 g L-aszparaginsavat kevertem össze főzőpohárban, majd a keveréket egy 1 L-s csepplombikba töltöttem. A lombikot egy Ika RV10 rotációs bepárló készülékre helyeztem, majd a nyomást folyamatosan csökkentettem 0-5 mbar közé, miközben a hőmérsékletet folyamatosan 180 ºC-ig növeltem. 7 órás reakció idő után végeredményül egy barna habot kaptam, amelyet 200 mL dimetil-formamidban (DMF) oldottam fel majd nagy mennyiségű vízben csaptam ki. Ezután a fehér precipitátumot semleges pH-ig vízzel mostam majd 40 ºC-n két napig szárítottam így végeredményül egy fehér port kaptam (8. ábra). A PSI átlagos molekulatömege a viszkozitás mérések alapján 28500±3000 g/mol-nak adódott [105, 113, 114].
8. ábra: A poli(szukcinimid) szintézisének lépései [114].
3.3 Poli(szukcinimid) módosítása: Poli(aszpartamid) alapú polimerek szintézise A szukcinimid monomerek könnyen reakcióba vihetőek nukleofil csoportot tartalmazó vegyületekkel, így a poli(szukcinimid) elhidrolizálható lúgos környezetben poli(aszparaginsav)-vá illetve funkcionalizálható primer amin csoportot tartalmazó vegyületekkel. Ezen reakciók során poli(aszpartamid) alapú polimereket állíthatunk elő, amelyek fizikai és kémiai tulajdonságait nagyrészt a módosító molekula fogja meghatározni. Ebben a fejezetben az általam előállított poli(aszpartamid) alapú funkcionalizált polimerek szintézisét fogom bemutatni.
3.3.1 Dopamin tartalmú poli(aszpartamid) alapú gyógyszerkonjugátumok előállítása
A dopamin (DA) a primer amin csoportjával lép reakcióba a PSI-vel miközben peptid kötések alakulnak ki a polimer lánc és a dopamin között (9. ábra). Munkám során két különböző csoportba tartozó konjugátumot szintetizáltam: az egyik csoportban a poli(szukcinimid)-et különböző mennyiségben módosítottam dopaminnal (PSI-DA), míg a másik csoportban a dopamin mellett 2-aminoetanolt (PSI-DA-AE) is használtam módosító molekulaként (9. ábra). A módosítás mértékét a graftolási fok (GF) jellemzi, ami megadható a monomer és a polimerre kötött dopamin mólarányával.
9. ábra: PSI-DA illetve PSI-DA-AE konjugátumok szintézise.
A csak dopaminnal módosított poli(szukcinimmid) előállításához feloldottam a PSI-t, illetve a dopamin-hidrokloridot dimetil-szulfoxidban majd a reakció elegyhez dibutil-amint (DBA) adtam a hidroklorid megkötéséhez. Ezután a reakció elegyet 45 ºC-n kevertettem 6 napig. A szintézisek során 1-es, 4-es, 10-es, 15-ös és 20-as graftolási fokú (GF=1, GF=4, GF=10, GF=15, GF=20) polimereket állítottam elő (1.
táblázat). A másik csoport esetében a dopamin mellett különböző mennyiségű
2-aminoetanolt (AE) adtam még a reakció elegyekhez majd ezeket is 6 napig 45 ºC-n kevertettem. A szintézisekhez a DA-t és AE-t 1/1 illetve 1/2 mólarányban alkalmaztam úgy, hogy minden monomer módosítva legyen (GF=1). A kész polimereket az összetételtől függően különböző eljárással nyertem ki: a GF1-s illetve két vegyesen módosított polimer esetében a reakció elegyet desztillált vízzel szemben dializáltam, majd a vizes oldatot fagyasztva szárítottam, míg a nagyobb graftolási fokú polimereket vízben kicsaptam, mostam majd 45 ºC-n szárítottam. Végtermékül különböző színű barna port kaptam. Az 1. táblázat a reakció elegyek pontos összetételét tartalmazza 1g polimer szintézise esetében.
1. táblázat: A reakcióelegyek pontos összetétele PSI-DA és PSI-DA-AE konjugátumok szintézisénél illetve a konjugátumokon található dopamin koncentrációja
DA:AE egységnyi dm3 konjugátumon lévő dopamin anyagmennyiségét mutatja mmol-ban.
3.3.2 PSI módosítása Arg-Gly-Asp (RGD) peptid szekvenciával
Az RGD tripeptidben található arginin szabad amin csoportja könnyedén reakcióba vihető a poli(szukcinimid)-el és így RGD funkcionalizált PSI állítható elő (PSI-RGDX, ahol X a graftolási fokot jelöli) melynek reakcióegyenlete a 10. ábrán látható.
10. ábra: Poli(szukcinimid) módosítása RGD tripeptid szekvenciával.
A reakcióhoz 10 mg RGD-t feloldottam 1,5 mL DMSO-ban (A oldat) majd 9,48 µL DBA-t adtam a reakcióelegyhez a pH beállításához. Ezután az oldatból különböző mennyiségeket kevertem össze PSI 25 m/m%-s DMSO-s oldatával, majd a reakció elegyeket 45 ºC-n 1 hétig kevertettem. A reakció során 300-as, 500-as, 1000-s, 5000-s és 10000-s graftolási fokú (RGD300, RGD500, RGD1000, RGD5000, RGD10000) polimereket állítottam elő. Az RGD300 minta esetében a polimert vízben csaptam ki, majd 45 ºC-n 3 napig szárítottam a polimer szerkezetének meghatározásához. A későbbi munka során az RGD tartalmú gélek szintéziséhez (3.7.2 fejezet) a reakcióelegyeket használtam fel a módosított PSI kipreparálása nélkül. A reakció elegyek pontos összetételei a 2. táblázatban találhatóak.
2. táblázat: PSI-RGDx polimerek előállításához használt reakcióelegyek összetétele
RGD300 RGD500 RGD1000 RGD5000 RGD10000
A oldat (µL) 378 227 114 23 12
PSI (g) 0,21 0,21 0,21 0,21 0,21
DMSO (mL) 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57
3.4 A PSI és módosított PSI polimerek analízisei
3.4.1 Kémiai szerkezet meghatározása Mágneses Magrezonancia (NMR) spektroszkópiával
Az NMR spektrumok felvételéhez egy JEOL SC400 spektrométert (JEOL Ltd., USA) használtam. A mérésekhez 10-15 mg polimert oldottam fel 600 µL DMSO-d6-ban illetve a PSI-DA-AE minták esetében D2O-ban majd az oldatokat 5 mm-s NMR csőbe töltöttem. A készülékhez egyszerre két mag manipulálására alkalmas inverz
szélessávú mérőfej, pulzusforma generátor, és pulzus térgradiens meghajtó (PFG) csatlakozott.
Az 1H-NMR spektrumot 3,2 s relaxációs idővel, 8 ismétléses méréssel, 400 MHz-s frekvenciával vettem fel.
A 2D 1H-1H-COSY NMR spektrumot 0,12 s relaxációs idővel, 256 ismétléses méréssel, 400MHz-s frekvenciával vettem fel.
3.4.2 Kémiai szerkezet meghatározása Fourier-transzformációs Infravörös Spektroszkópiával (FTIR)
A kísérleti munkámhoz minden esetben az alábbi készüléket és annak beállításait használtam: az FTIR méréséhez egy gyémánt Gyengített Totálreflexiós (ATR) (JASCO Ltd., ATR Pro ONE) fejjel és DTGS detektorral ellátott JASCO 4700A készüléket használtam. Az átlag spektrum felvételéhez 80 párhuzamos mérést végeztem, 4000-400 cm-1 hullámhossztartományban, 4 cm-1 felbontással. A mérések után a végső spektrumokat víz, CO2 és alapvonal korrekció után kaptam meg.
3.4.3 Termogravimetriás (TG) és Differenciál Kalorimetriás (DSC) mérés
A polimerek termikus stabilitásának vizsgálatához (TG) néhány mg polimert helyeztem egy TGA Q500 (TA Instruments, USA) készülékbe. A TG mérést 30 °C és 600 °C között végeztem 10 °C/perces felfűtési sebességgel, levegő atmoszférán. ADSC mérésekhez néhány mg polimert helyeztem egy DSC Q2000 (TA Instruments, USA) készülékbe. A mérést -40 °C és 200 °C között végeztem nitrogén atmoszférán 5
°C/perces fűtési/hűtési sebességgel 3 lépésben: először a mintát felfűtöttem 200 °C-ig majd lehűtöttem -40 °C-ig, majd ismét felfűtöttem 200 °C-ig.
3.5 PSI-DA és PSI-DA-AE minták vizsgálata
3.5.1 Dopaminnal módosított minták oldhatóságának és oldhatóság kinetikájának vizsgálata
A minták oldhatóságának meghatározásához 0,1 g polimer-dopamin konjugátumot helyeztem 11 mL ultra-tiszta vízbe (UT víz) majd a rendszert mágneses keverőn kevertettem 24 és 48 óráig. Ezután az oldatokat 0,2 µm pórusátmérőjű polipropilén fecskendőszűrővel (VWR, Magyarország) szűrtem majd Agilent 8453 UV-VIS spektrofotométerrel (Agilent Technologies, USA) meghatároztam az
abszorbanciájukat 280 nm-n, ahol a dopamin fényelnyelési maximum található. A koncentrációk meghatározásához kalibrációs oldatsorozatot készítettem dopaminnal ugyanolyan körülmények között 0-0,6 mmol/L koncentráció tartományban (egyenes egyenlete 11. ábra).
11. ábra: Dopamin UV-VIS kalibrációs egyenese a) ultratiszta (UT) vízben b) n-oktanolban. Az abszorbancia 280 nm-n lett meghatározva
A PSI-DA GF=1 és GF=4 konjugátumok esetében meghatároztam a minták oldhatósági kinetikáját is. Ehhez 0.3 g polimer konjugátumot helyeztem 18 mL MQ vízbe és különböző időközönként mértem az oldatok abszorbanciáját 280 nm-n egészen 2 napig. A koncentráció meghatározásához a 11. a ábrán látható kalibrációs egyenes egyenletét használtam.
3.5.2 Dopaminnal módosított minták lopifilitásának (lgP) meghatározása
A konjugátumok lgP értékeinek meghatározásához a klasszikus rázótölcséres módszert alkalmaztam. Ehhez először a konjugátumokból telített oldatot készítettem ultratiszta (UT) vízben, majd 10 mL-t egy rázótölcsérbe helyeztem. Ezután azonos térfogatú n-oktanolt adtam a rendszerhez, összeráztam, majd 24 órán keresztül állni hagytam. 24 óra elteltével mértem az oktanolos illetve a vizes fázis abszorbanciáját egyaránt Agilent 8453 UV-VIS spektrofotométerrel. Ezután az oldatokat visszatöltöttem a rázótölcsérbe, összeráztam majd 24 óra elteltével ismét elvégeztem a mérést. A koncentráció meghatározásához a kalibrációs mérést szabad dopaminnal elvégeztem n-oktanolban egyaránt 0-0,6 mmol/L-s koncentráció tartományban. Az UT vizes és oktanolos kalibrációs oldatsorozat illesztett egyenese a 11. ábrán látható.
A lgP értékeket a két fázisban mért koncentrációk arányaként adhatjuk meg az 1.
3.5.3 Dopamin leszakadási kinetikájának és degradációjának meghatározása A dopamin leszakadási kinetikájának meghatározásához a 0,1 g PSI-DA illetve PSI-DA-AE por konjugátumot töltöttem egy 3.5 kDa áteresztő képességű dialízis hártyába, hogy elválasszam a konjugátumot illetve a leszakadt kis molekulás dopamint egymástól. A dopamin leszakadási kinetikáját meghatároztam foszfát pufferben (PBS, pH=7.5 c=100 mM), illetve különböző enzimek: bromelain, illetve α-Kimotripszin jelenlétében. A dializáló hártyába 6 mL puffert vagy enzim oldatot töltöttem (3 mg/ml enzim koncentráció ugyanolyan PBS-ben), majd ezt a főzőpohárba helyeztem, amely minden esetben 60mL PBS-t tartalmazott. A reakció elegyet 37±1 °C-n termosztáltam és különböző időközönként mértem a külső oldat abszorbanciáját 2 napig az előzőekben említett Agilent 8453 UV-VIS spektrofotométer átfolyós küvetta segítségével. A leszakadt dopamin átlag koncentrációját a 11. a ábrán látható kalibrációs egyenes segítségével határoztam meg 3 párhuzamos mérésből. Mivel a dopamin a mérési körülményeken degradálódik, ezért meghatároztam a dopamin degradációjának kinetikáját a mérési körülményeken. Ehhez 0,1 mg/mL-s dopamin-hidroklorid oldatot készítettem és mértem az oldat abszorbanciájának csökkenését 280nm-n. Ezeket a méréseket a későbbiekben felhasználtam a dopamin pontos koncentrációjának meghatározásához. A mérés felépítése és a mérés során lejátszódó különböző kémiai és fizikai folyamatok a 25. ábrán láthatóak.
Az elektrosztatikus szálhúzással készített nanoszálas konjugátumoknál a dopamin leszakadás kinetikájának a méréséhez is ezt a mérési összeállítást használtam azzal a különbséggel, hogy 100 mg minta helyett 50 mg-ot mértem be. Emellett a méréseket csak PBS-ben és α-Kimotripszin jelenlétében végeztem a GF=1 és GF=4-es mintákkal.
3.5.4 Dopamin degradációjának tömegspektrometriás (MS) analízise
A dopamin degradátumok jelenlétét és a kicsapódott fekete csapadék szerkezetét tömegspektrometriával (MS) határoztuk meg. A mérést egy Agilent 1200 Series HPLC
rendszerrel végeztük, amelyhez egy gázmentesítő (Agilent 1260), egy bináris pumpa (Agilent 1290), egy automata mintaadagoló (Agilent 1260), egy kolonna termosztát (Agilent 1290) és egy tripla quadrupól spektrométer (QQQ) (Agilent 6460) kapcsolódott.
A méréshez a mintákat 1 V/V%-s ecetsav/UT vizes oldatával hígítottuk.
Eluensként 40:60 arányú acetonitrile:UT vizet (1% ecetsav) használtunk. A mérésekhez 5 µl mintát injektáltunk a kolonnára és 0.3 mL/perc eluálási sebességet használtunk.
A tripla kvadrupól tömegspektrométerben a normál MS és tandem MS mérésekhez Jet Stream elektroporlasztásos ionforrást használtunk pozitív ionmódban. A kapilláris feszültséget 1950 V-ra míg a kapilláris hőmérséklet 300 °C-ra állítottuk.
Porlasztó, köpeny és ütköző gázként nitrogén használtunk. A beállítási paraméterek a következőek voltak: gáz áramlási sebesség 10 min-1, porlasztó gáz áramlás 45 psi, köpeny gáz áramlása 11 min-1, hőmérskélete 250 °C, fragmentor feszültség 135 V. Az MS méréseket 50-500 Da m/z tartományban végeztük. A mérésekhez és a kiértékeléshez Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis szoftvert (verziószám:
B.02.01) használtunk.
3.6 PSI-DA és PSI-DA-AE alapú nanoszálas rendszerek készítése és vizsgálata 3.6.1 Nanoszálas rendszerek készítése elektrosztatikus szálhúzás
(electrospinning) segítségével
Elektrosztatikus szálhúzáshoz egy általunk összeállított készüléket használtam, mely a 12. ábrán látható.
A dopaminnal módosított polimerek elektromos szálhúzásának a körülményeit az Isztambuli Műszaki Egyetemen Prof. Sezai A. Sarac témavezetése alatt dolgoztam ki.
A polimer oldatot egy műanyag 2 mL össztérfogatú fecskendőbe töltöttem, amelyet egy G10-es tompa tűvel láttam el. Ezután a fecskendőt egy fecskendőpumpára (KD Scientific, KDS100) helyeztem, rögzítettem, majd a pozitív elektródot a tűhöz, míg a földet a fémgyűjtő laphoz csatlakoztattam. A szálhúzás során használt feszültséget egy GENVOLT 73030P egyenáramú tápegység biztosította. A szálhúzás során használt paraméterek és a 3. táblázatban láthatóak.
12. ábra: Elektrosztatikus szálhúzáshoz használt készülék összeállítása.
Amint az megfigyelhető a 3. táblázatban a GF=1 és 4-s minta esetén többféle paramétert használtam. A szálak fizikai megjelenésében és átmérőjében lévő különbséget a későbbi fejezetek során fogom ismertetni.
3. táblázat: PSI-DA és PSI-DA-AE polimerek elektromos szálhúzása során alkalmazott paraméterek
3.6.2 Elektrosztatikus szálhúzással készített szálak vizsgálata pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM)
A szálak mikroszkópos jellemzéséhez és átmérőjének meghatározásához egy Quanta 400F pásztázó elektronmikroszkópot használtam különböző nagyításban (Isztambuli Műszaki Egyetem, Isztambul, Törökország). 2-20 kV közötti gyorsító feszültséget alkalmaztam a képek felvételéhez és a jobb kontraszt érdekében a minták felületén arany bevonatot hoztam létre egy MCM-100 Model fémion szóró berendezés
segítségével. A szálak átlagos átmérőjének meghatározását 100 szál méréséből végeztem az ImageJ képanalizáló program segítségével [115].
3.6.3 Elektrosztatikus szálhúzással készített szálak vizsgálata Atomerő mikroszkópiával (AFM)
A polimer szálak felületének vizsgálatához Cypher atomierő mikroszkópot (Asylum Research, Santa Barbara, CA, USA) használtunk IgorPro 6 (Wavemetrics, Lake Oswego, OR) szoftverrel. A vizsgálatokhoz a szálakat ragasztóval rögzítetük egy tárgylemez felületére, hogy az AFM tűje ne mozdítsa el őket a vizsgálat közben. A szálakat levegőn mértük oszcillációs módban 0,2-1 Hz-s pásztázó frekvencián, 0,3-0,5 kV célértékkel. A mérések során 3x3 µm2-s területeket mértünk.
3.6.4 Elektrosztatikus szálhúzással készített szálak vizsgálata két foton mikroszkópiával
A szálak vizsgálatát Femtonics két foton mikroszkóppal (Femto2D, Femtonics, Hungary) végeztem. A poli(aszparaginsav) autofloureszcenciájának köszönhetően a szálak vizsgálatához nem volt szükség semmilyen flouroaktív jelölő használatához. A szálak gerjesztéséhez MaiTai DeepSee lézert (Spectra Physics, USA) használtam 800 nm-n. A felvételek rögzítéséhez 10X nagyítású objektívet, és MES4.4v programot használtam. A felvételek kontrasztjának és fényességének beállításához ImageJ programot használtam [115].
3.6.5 Elektrosztatikus szálhúzással készített szálas rendszerek oldhatóság kinetikájának meghatározása PBS-ben
A PSI-DA GF=1 és GF=4 szálak oldhatóság kinetikáját hasonló eljárással végeztem, mint a por minták esetében. A mérés során 50 mg szálas polimer konjugátumot helyeztem 10 mL PBS-be és kevertetés mellett mértem az oldat abszorbanciáját 280 nm-n különböző időközönként 2 napon át Agilent 8453 UV-VIS spektrofotométer segítségével. A polimer koncentrációjának meghatározásához az 11. a ábrán látható kalibrációs egyenes egyenletét használtam.
3.6.6 A konjugátumok membrán permeábilitásának jellemzése Parallel Mesterséges Membrán Permeábilitási (PAMPA) módszerrel
A vizsgálatokhoz 96 lyukú donor mikrotiter lemezt (EMD Millipore, USA) és egy bele illeszkedő 96 lyukú poli(vinilidén-difluorid) membránt (0,45 µm, EMD Millipore, USA) tartalmazó akceptor lemezt használtunk. A donor oldalra 0,5 mg szálas polimer konjugátum lapokat helyeztünk majd 330 µL 1 g/mL nátrium-dodecil-szulfát (NaDS)/PBS oldatot pipettáztunk. Kontrol mérésként ugyanilyen koncentrációjú dopamin-hidrokloridot illetve üres NaDS/PBS oldatot használtunk. Ezután a donor lemezre helyeztük a membránnal ellátott akceptor lemezt, amelybe előzőleg 5 μL 20 m/m%-s Izolecitin/dodekán elegyét pipettáztuk, amely a mesterséges membrán szerepét látja el a kísérletek során. Ezután a donor oldalra 150 µL 1 g/mL NaDS/PBS oldatot pipettáztunk majd a rendszert 4, illetve 28 órára állni hagytuk fénytől elzárva szobahőmérsékleten. 4 és 28 óra elteltével mértük az oldat abszorbanciáját a donor, illetve az akceptor oldalon egyaránt, NanoDrop 2000 UV-VIS spektrofotméterrel (Thermofischer, USA).
3.6.7 Polimer konjugátumok és szálas minták citotoxicitásának vizsgálata humán eredetű periodontális ligamentum (PDL) őssejtekkel
A citotoxicitás vizsgálatok során két különböző mérési sorozatot végeztünk a Semmelweis Egyetem Orálbiológia tanszékével együttműködésben. Az első vizsgálat során mértük különböző dopamin és konjugátum koncentráció esetén az életképes sejtek mennyiségét WST-1 reagens segítségével, míg a második mérésnél vizsgáltuk a különböző szálas konjugátumok közötti különbséget egy adott koncentráció mellett. Az első vizsgálatban a dopamin és a PSI-DA-AE 1:2 mintára kötött dopamin koncentrációját 1 µM-1 mM tartományban változtattuk. A kísérletek menetét egészen a sejtek kinyerésétől a következő fejezetekben ismertetem.
3.6.7.1 PDL őssejtek passzálása
A sejtek impaktált humán felnőtt bölcsességfogakból történő izolálása után fagyasztásra kerültek. Az első kísérletsorozathoz két különböző páciensből származó PDL őssejteket olvasztottunk fel, azokat egyenként 2 db T75-s flaskába ültettük ki majd egy hétig felszaporítottuk őket inkubátorban (Orange Scientific, Belgium) szabvány körülmények között (37 °C, 5% CO2, 100% páratartalom) 3 naponta tápoldatot cserélve.
A kísérletekhez α-MEM tápoldatot használtunk, amely 10 % fetális marha szérumot, 2 mM L-glutamint, 100 egység/mL penicilint és 100 mg/mL sztreptomicint is tartalmazott. A passzáláshoz a sejteket 1:5 arányú 0,05%-s Tripszin/EDTA oldattal távolítottuk el a tenyésztő edény aljáról.
3.6.7.2 Sejtek életképességének vizsgálata [2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium] WST-1 reagens segítségével
A vizsgálatokhoz 10000 sejt/cm2 sejtsűrűséggel dolgoztunk minden egyes kísérleti lyukban egy 96 lyukú mikrotiter lemezen. A sejtek kiültetése után 1 nappal mértük az életképes sejtek mennyiségét WST-1 reagens segítségével. Ehhez a tápoldatot lepipettáztuk a sejtekről, majd 100 µL 1:20-as hígítású WST-1/PBS oldatot pipettáztunk a lyukakba. Ezután a reagens lemezeket 2 órán keresztül inkubáltuk és mértük a minták abszorbanciáját 450 nm-n egy BIO-RAD 3550 (Bio-rad Laboratories, Japan) mikrotiter lemezolvasó segítségével. A mérést a különböző páciensekből származó sejteknél 5 párhuzamossal végeztük és háttérként az ugyanabban a mérésben 655 nm-nél mért abszorbanciát használtuk. Ezután hozzáadtuk a sejtekhez a különböző koncentrációjú dopamin-hidroklorid, illetve PSI-DA-AE 1:2 tápoldatban készült oldatait, majd 1 és 3 nap elteltével mértük az életképes sejtek mennyiségét az előzőekben ismertetett módszer szerint.
Az elektrosztatikus szálképzéssel előállított minták esetében hasonlóan 10000 sejt/cm2 sejtsűrűséggel dolgoztunk. A sejteket kör alakú mikroszkóp fedőlemezre ültettük ki. Ezután a sejtekre α-MEM tápoldatot pipettáztunk, majd hozzáadtuk az előre elkészített és ClO2-vel sterilizált mintákat. A sejtek életképességét 1 és 3 nap elteltével mértük WST-1 reagens segítségével az előbb ismertetett módon.
3.6.7.3 Sejtek morfológiájának vizsgálata fáziskontraszt mikroszkópiával
A sejtek morfológiáját a hatóanyag konjugátumok hozzáadása után 1 és 3nappal vizsgáltuk. Ehhez egy Nikon Eclipse TS100 inverz fázis kontraszt mikroszkópot (Nikon, Japan) használtunk. A felvételeket 10X nagyítású objektívvel, egy nagyfelbontású CCD kamera (COHU, USA) és Scion program segítségével rögzítettük.
3.6.7.4 Sejtek előkészítése két foton mikroszkópiás vizsgálatokhoz
A kétfoton mikroszkópiás vizsgálathoz Vybrant DiD festékkel még a kiültetés előtt megfestett sejteket használtunk. A PDL őssejteket egy kör alakú mikroszkóp
fedőlemezre ültettük ki, majd hozzáadtuk az előzőleg elkészített és sterilizált szálas konjugátumokat. 3 nap elteltével a mintákat lepipettáztuk és a sejteket 4%-s paraformaldehid oldattal fixáltuk a fedőlemezek felületén. A mikroszkópiás vizsgálatokhoz a 3.6.4 fejezetben ismertetett mikroszkópot és beállításokat használtam.
3.7 Poli(szukcinimid) és poli(aszparaginsav) alapú gélek szintézise
Mivel a PSI könnyen reakcióba vihető primer amin csoportot tartalmazó vegyületekkel, így kettő- vagy többfunkciós aminokkal keresztkötéseket hozhatunk létre a polimer molekulák között géleket szintetizálva. A gélek szintézise során kétféle keresztkötő molekulát, cisztamin-hidrokloridot (CYS) illetve diaminobutánt (DAB) használtam különböző mennyiségben. Gélek szintéziséhez mind a módosítatlan mind pedig a módosított polimereket egyaránt használtam.
3.7.1 Különböző keresztkötőt tartalmazó PSI gélek előállítása
A gélek szintéziséhez a PSI 25m/m%-os oldatát különböző mennyiségű és összetételű keresztkötő molekula DMSO-s oldatával kevertem össze. Cisztamin keresztkötőt tartalmazó gélek esetében a reakció elegyhez DBA-t adtam a cisztamin-hidrokloridból származó hidroklorid megkötéséhez. 1 gramm gél szintéziséhez használt reakcióelegyek pontos összetétele a 4. táblázatban található.
4. táblázat: PSI gélek előállításához használt elegyek összetétele Minta neve 25m/m% PSI oldat
esetben 15m/m%-s kezdeti polimer koncentrációval illetve 10-es, 20-as és 40-s kezdeti térhálósítási fokkal (TF: monomerek és keresztkötő molekulák mólaránya) szintetizáltam. A keresztkötési reakciók a 13. ábrán láthatóak.
1 nap gélesedés után a kész géleket DMSO-ba helyeztem, hogy az elreagálatlan molekulákat kimossam, illetve a gél felvegye az egyensúlyi térfogatát. A mintákat ezt követően különböző kezeléseknek vetettem alá a további kísérletek előkészítéséhez.
13. ábra: PSI gélek előállítási reakciói különböző keresztkötővel.
3.7.2 RGD tartalmú PSI gélek szintézise
Az RGD tartalmú gélek szintéziséhez a 3.3.2 fejezetben leírt, RGD-vel módosított polimerek reakció elegyeit használtam fel, keresztkötőként DAB és CYS 1/1 mólarányú keverékét alkalmaztam. A 2. táblázatban található reakcióelegyeket (B oldat), a polimer kinyerése nélkül összekevertem a DAB és CYS DMSO-s oldatával és DBA-t adtam az elegyhez a CYS-ben található hidroklorid megkötéséhez. Ezután a keverékeket 0,75 mm vastag keretbe töltöttem és hagytam 1 napig gélesedni. A gélesedési reakció általános egyenlete a 14. ábrán látható.
14. ábra: PSI-RGDX-CYS20-DAB20 gélek szintézisének általános egyenlete.
A szintetizált gélekben az RGD mennyisége a 3.3.2 fejezetben leírtak alapján változott, vagyis minden 300., 500., 1000., 5000. és 10000. monomer tartalmazott RGD oldalláncot. A gélek pontos összetétele az 5. táblázatban található.
5. táblázat: PSI-RGDX-CYS20-DAB20 gélek pontos összetétele a gélesedés során
PSI-RGD300 PSI-RGD500 PSI-RGD1000 PSI-RGD5000 PSI-RGD10000
B oldat (mg) 1256,5 1090,5 965,8 865,2 852,6
CYS.2HCl (mg) 24,4 24,4 24,4 24,4 24,4
DAB (µL) 10,9 10,9 10,9 10,9 10,9
DBA (µL) 36,6 36,6 36,6 36,6 36,6
DMSO (mg) 98 251 377 474 486
A különböző RGD tartalmú gélek ugyanolyan TF-el rendelkeztek, amely összetétel megfelel a 4. táblázat 5. sorának (kiemelt sor). Az 1 napos gélesedés után a gélfilmeket DMSO-ba helyeztem, hogy eltávolítsam az el nem reagált molekulákat és a
A különböző RGD tartalmú gélek ugyanolyan TF-el rendelkeztek, amely összetétel megfelel a 4. táblázat 5. sorának (kiemelt sor). Az 1 napos gélesedés után a gélfilmeket DMSO-ba helyeztem, hogy eltávolítsam az el nem reagált molekulákat és a