Elektrofiziológiai módszerek

A mérések 500 µl térfogatú plexi mérőkádban készültek, melyben a folyadékcsere sebessége 4-5 ml/perc volt. A kísérletek végzésekor a sejtszuszpenzióból egy cseppet transzferpipettával a kádba cseppentettünk, majd néhány perc ülepedést követően megindítottuk a perfúziót. A kísérletekhez szabályos téglalap alakú, tiszta harántcsíkolattal rendelkező sejteket választottunk ki, melyek spontán kontrakciót nem mutattak.

Az elektrofiziológiai kísérleteket 37 °C-on végeztük, hacsak a tudományos probléma nem indokolta eltérő hőmérséklet alkalmazását. Ezen speciális esetekben a használt hőmérséklet az Eredmények fejezetben egyedileg feltüntetésre került. A hőmérsékletszabályozás pontossága 0.5 °C-on belül volt.

Az elektrofiziológiai mérések Axon rendszereken készültek (Axon Instruments, illetve Molecular Device).

A kísérletekhez Axoclamp 2B és Axopatch 200B erősítőket valamint Digidata sorozatú analóg/digitális

20

jelátalakítókat (12xx és 14xx) használtunk, az analóg szűrés 10kHz-en történt. A mérésekhez és a mért jelek elemzéséhez pClamp és ClapFit programokat használtunk.

A mérésekhez használt elektródák boroszilikát üvegből készültek Sutter rendszerű programozható húzókon (Sutter Instruments, Novato CA), közvetlenül a mérés előtt. A soros ellenállást és a sejtek kapacitását a kísérlet során többször ellenőriztük, jelentős változás esetén (Rm>50%, Cm>10%) a kísérletet megszakítottuk.

5.3.1. Hagyományos voltage clamp mérések

Kísérleteink során teljes sejtes elrendezésben („whole cell configuration”) dolgoztunk. A hagyományos, vagyis négyszög alakú parancsjeleket, illetve rámpát alkalmazó mérésekhez használt elektródák ellenállása 2.0 - 3.5 MΩ volt. A feltöltést követően a pipettákat a perfúziós oldatba merítve voltage clamp konfigurációban nulláztuk, majd a sejt felszínéhez érintve enyhe szívással létrehoztuk a gigaseal-t, majd kompenzáltuk a soros ellenállást (100%) és a pipetta kapacitását (80%). A betöréshez erősebb szívást alkalmaztunk, majd a sejtet mintegy 10 percen keresztül egyenként 100 ms hosszú -130/-80/-40/+10 mV-os lépcsőkből álló protokollal ingereltük 1 Hz frekvencián. Ez idő alatt a sejtplazma és a pipetta oldat kiegyenlítődött, az áramjelek stabilizálódtak. Amennyiben a sejt áramjelei 10 perc alatt nem stabilizálódtak, a sejtet mérésre nem használtuk fel.

Amennyiben a sejt áramjelei stabilzálódtak, a külső oldatot a kísérleti protokollnak megfelelő összetételűre cserélve a mérés megkezdődhetett.

5.3.2. Akciós Potenciál Clamp mérések

Az AP clamp kísérletekben a mérési elrendezés megegyezett a hagyományos voltage clamp kísérletekben alkalmazottéval két fontos különbséggel. Egyrészt a parancsjel - szemben a hagyományos négyszög, esetleg rámpa alakú parancsjelekkel – itt mindig egy AP. Ezen a ponton fontos kiemelni, hogy AP Clamp kísérleteinkben mindig a sejt saját AP-ját használtuk parancsjelkén, hacsak a tudományos probléma nem indokolta más sejten rögzített AP használatát. Ilyen eset volt például az EPI-ENDO sejtek összehasonlító tanulmányozása, amikor vizsgáltuk EPI sejteken ENDO AP, illetve ENDO sejteken EPI AP hatásait az ionáramok profiljára. Az eredményekben bemutatásra kerülő AP Clamp módszerrel készült áramprofilokat tehát alapvetően a sejt saját AP-ja alatt rögzítettük, illetve az ellenkező eseteket egyértelműen jelöljük. A másik fontos különbség az AP Clamp kísérletekben az alkalmazott külső- és belső oldatok összetétele. Míg a hagyományos voltage clamp kísérletekben a pipetta oldat és a külső

21

oldat összetételét úgy választjuk meg, hogy a mérni kívánt ionáram kivételével minden más ionáramot gátoljunk, az AP Clamp kísérletekben törekszünk a membrán mindkét oldalán az élettani viszonyokhoz legközelebb álló ionösszetételt biztosítani. Ennek oka az AP Clamp kísérletek sajátságos logikája.

A hagyományos voltage clamp kísérletek alapelve, hogy ha a sejt valamennyi ionáramát gátoljuk a mérni kivánt ionáram kivételével, akkor a teljes membránáram (Im) meg fog egyezni a tanulmányozni kívánt ionárammal. Ennek megfelelően a külső és belső oldatokból lehetőség szerint kihagyjuk mindazon ionokat, amelyek a mérést zavarnák, illetve a mérni nem kívánt ioncsatornákat nagy specificitású gátlószerekkel gátoljuk. Ezzel szemben az AP Clamp kísérletekben úgy járunk el, hogy a későbbiekben mérésre használt AP-t fiziológiás, vagy ahhoz minél közelebb álló viszonyok között Áram Clamp konfigurációban rögzítjük. Amennyiben ezt az AP-t voltage clamp konfigurációban parancsjelként alkalmazzuk ugyanazon sejten, az erősítőnk a teljes elektromos ciklus alatt nulla áramot fog kompenzációs áramként a sejtre adni (eltekintve az AP-t megelőző ingerlőjel alatti szakasztól, ahol a kompenzációs áram nullától különbözik). Ennek oka az, hogy a sejt nem igényel külső áramot saját AP-ja soán. Ha ezek után egy ionáramot specifikus gátlószerrel legátlunk, a kiesett áramot az AP profiljának megtartásához az erősítőnek kell biztosítania. Amennyiben ezt a kompenzációs áramot kivontuk a gátlószer alkalmazása előtti nulla áramból, megkaptuk a vizsgálni kívánt ionáram AP alatti profilját. Tehát a hagyományos voltage clamp kísérletek során egy mesterséges (négyszög, rámpa) parancsjel során az élettanitól jócskán eltérő ionösszetételű közegben létrejövő áramprofilt kapunk, amelyből az AP alatti áramprofilt bonyolult matematikai módszerekkel határozhatjuk meg. Ezzel szemben az AP Clamp módszerével a tanulmányozni kívánt ionáram AP alatti profilját közvetlenül határozzuk meg az élettanihoz lehető legközelebb álló ionösszetétel mellett.

5.3.3. Current Clamp mérések

Kétféle, kis- és nagy ellenállású elektróddal végzett current clamp módszert alkalmaztunk. Kis ellenállású elektród („pipetta”) esetén az elektróda ellenállása 2.0 – 3.5 MΩ, a nagy ellenállású („hegyes”) elektródák ellenállása 20-30 MΩ között volt. A pipettákat hagyományos kálium aspartat alapú belső oldattal töltöttük fel, a hegyes elektródákhoz 3 mol/l koncentrációjú KCl oldatot használtunk. A két mérés alapelve és technikai kivitelezése ugyan azonos, de pipetta használatakor a pipetta oldat a sejt belső terét dializálja, míg hegyes elektróda esetén dialízis nincs. Pipettával történő mérés esetén a mérési konfigurációt a voltage clamp módszerhez hasonlóan érjük el, míg hegyes elektródás mérésnél az elektróda hegyének kis átmérője miatt a sejtet egyszerűen megszúrjuk, illetve ha szükséges, a betöréshez nagyfrekvenciájú árampulzust („zap”) alkalmazhatunk.

22

A betörést követően a sejteket általában 1-2 percen át fokozatosan csökkenő erősségű árammal hyperpolarizáltuk és általában 1 Hz frekvencián ingereltük. A folyamatos ingerlést fenntartva az AP paraméterei néhány percen belül stabilizálódtak. Ha a stabilizáció 10 percen belül nem következett be, a sejtet nem használtuk fel méréshez. Current clamp méréseknél a sejteket folyamatosan ingereltük 1 ms szélességű, a küszöböt 20-30%-al meghaladó amplitúdójú négyszögjellel. Az ingerlés a mérő elektródán keresztül történt az erősítő bemenetéhez csatlakoztatott biológiai ingerlő segítségével. Az ingerlő típusának megválasztásakor fontos szempont volt, hogy a nulla érték 10 µV alatt legyen, megelőzendő a nyugalmi membránpotenciál módosítását.