Az elúciós sorrend alakulása kinin és kinidin alapú állófázisokon

Az elúciós sorrend megállapításának kiemelkedő fontossága van a sztereoizomerek elválasztásában; mind a minőségi azonosítás, mind a mennyiségi meghatározás megbízhatósága jelentősen függhet attól, hogy a kisebb mennyiségben jelenlévő szennyező a főkomponens előtt vagy után eluálódik. Amint azt korábban említettem a kinin és a kinidin öt királis centrumából három konfigurációja megegyezik, míg a királis felismerés szempontjából meghatározó jelentőségű 8. és 9. szénatom ellentétes konfigurációjú, így a két molekula pszeudoenantiomer viszonyban áll egymással. Az anioncserélő tulajdonságú QN-AX és QD-AX állófázisokon védőcsoportot tartalmazó α-aminosavak esetén (1–19) kettő kivételtől eltekintve (11, 14) bizonyítékkal szolgáltunk az ellentétes elúciós sorrendre [E15]. Említést érdemel, hogy a vegyületcsoport esetén (1–19) az anioncserélő

tapasztaltunk az ikerionos, szintén kinin alapú ZWIX(+) kolonnán, és az elúciós sorrend még SFC körülmények között sem változott [E16]. Ehhez hasonlóan a kinidin alapú QD-AX és ZWIX(–) oszlopokon meghatározott elúciós sorrendek is megegyeztek [E17]. A ZWIX(+) és ZWIX(–) oszlopokon kapott eredményeink sok esetben bizonyították a pszeudoenantiomer jelleg érvényesülését; a két oszlopon ellentétes elúciós sorrend alakult ki ß-aminosavak [E1–E4, E7, E9, E10, E14], szekunder aminosavak [E5], tetrahidroizokinolin analógok [E6], izoxazolinok [E8] és aminohidroxámsavak esetén [E12]. Az ikerionos állófázisok alkalmazásával tehát egyszerűen az oszlopok cseréjét követően (a kromatográfiás körülmények számottevő változtatása nélkül) lehetőség nyílik az elúciós sorrend megváltoztatására, ami jelentős előnyökkel jár, különösen, ha kicsi koncentrációban jelenlevő komponens mennyiségi meghatározása a feladat. Az ikerionos állófázisok kationcserélő funkciós csoportot hordozó alegysége (ACHSA) két királis centrumot tartalmaz, így a kinin és kinidin alegységekhez kapcsolva elvileg nyolc különböző szelektor kialakítása lehetséges. Amint azt korábban említettem ebből kettő kereskedelmi forgalomban van (ZWIX(+) és ZWIX(–)), míg másik kettő (ZWIX(+A) és ZWIX(–A) ) kutatási célokra számunkra elérhető. (cisz-ACHSA beépítésével eddig nem állítottak elő szelektort.) Az egyes állófázisok szetereokémiai kapcsolatát a 22. ábrán mutatom be.

22. ábra

Az alkalmazott ikerionos szelektorok sztereokémiai viszonyai

A sztereoizomerek elúciós sorrendjét végső soron a szelektor és az egyes szetereoizomerek között kialakuló kölcsönhatások erőssége fogja meghatározni.

Természetesen ez az abszolút konfigurációk és a „konformációs flexibilitás” által meghatározott térbeli elrendeződés függvénye lesz. A vizsgált szelektorok az elúciós sorrend tanulmányozásán keresztül kiváló lehetőséget biztosíthatnak a királis felismerés szempontjából meghatározó kölcsönhatások feltérképezésére. Az említett négy oszlop

fontosabb fizikai paraméterei megegyeznek, így az elúciós sorrend vizsgálatán keresztül lehetőség nyílik a szelektorokat felépítő alegységek királis felismerésben betöltött szerepének jellemzésére.

A szelektort felépítő alegységek retenciós sorrendre kifejtett hatását ciklusos ß-aminosav enantiomerek (86–88, 91, 106–109) elválasztása során kapott eredményeken keresztül mutatom be [E14]. A négy oszlopon tapasztalt elúciós sorrendet állandó összetételű eluenst (MeOH/MeCN 50/50 v/v és 50 mM AcOH és 25 mM DEA) alkalmazva az 5. Táblázatban adtam meg. Amint azt a 22. ábrán bemutattam, a ZWIX(+) és a ZWIX(–), illetve a ZWIX(+A) és a ZWIX(–A) oszlopok egymással pszeudoenantiomer viszonyban állnak, míg minden más összevetésben diasztereomerek.

5. Táblázat

Ikerionos állófázisokon tapasztalt elúciós sorrend néhány ß-aminosav enantiomer esetén

Vegyület Sorrend

ZWIX(+) ZWIX(–) ZWIX(+A) ZWIX(–A)

86 a<b b<a b<a a<b

106 b<a a<b nm b<a

87 a<b b<a b<a a<b

107 b<a a<b nm b<a

cisz-88 a<b b<a b<a a<b

cisz-108 b<a a<b a<b b<a

transz-88 b<a a<b b<a a<b

transz-108 b<a a<b nm a<b

91 a<b b<a b<a a<b

109 b<a a<b a<b b<a

nm: Az adott eluensrendszerrel nem váltak el az enantiomerek.

Az 5. Táblázatban feltüntetett adatokból kiválóan látszik, hogy az elúciós sorrend minden esetben ellentettjére változik az egymással pszeudoenantiomer viszonyban levő állófázisokon. Érdemes kiemelni, hogy egyetlen kivételtől (transz-88) eltekintve a ZWIX(+) és a ZWIX(+A), illetve a ZWIX(–) és a ZWIX(–A) (transz-108 kivételével) oszlopokon is fordított elúciós sorrendet tapasztaltunk, azaz a kationcserélő ACHSA alegység konfigurációjának megváltoztatása elegendő az elúciós sorrend megfordításához.

Eredményeink alapján kijelenthető, hogy az esetek többségében a vizsgált

ß-aminosavaknál a kationcserélő funkciós csoport konfigurációja a meghatározó az enantiomerek elúciós sorrendjének szempontjából.

Magyarázatként elmondható, hogy a vizsgálati körülmények között alkalmazott savfelesleg kedvez az aminocsoport protonálódásának, míg kevésbé kedvez a karboxilcsoport deprotonálódásának. Ennek megfelelően az anionos és kationos kölcsönhatások nem egyenlő mértékben vesznek részt a királis felsimerés szempontjából meghatározó jelentőségű, a szelektorral átmenetileg képződő diasztereomer kialakulásában, így a kationcsere folyamata lesz a meghatározó.

Az elúciós sorrend tárgyalásánál a szelektor szerkezeti jellemzői mellett az elválasztandó enantiomerek szerkezeti sajátosságait is meg kell említeni. Az aminocsoporton metilezett enantiomerek elúciós sorrendjét a nem metilezett aminosavak enantiomerjeinek sorrendjével összevetve (5. Táblázat) kitűnik, hogy egyetlen kivételtől eltekintve (a transz-88 és transz-108 enantiomerpárok) a metilálás mindegyik vizsgált állófázis esetén fordított elúciós sorrendet eredményezett. Ez a kísérleti tapasztalat rávilágít arra, hogy a vizsgált vegyületek szerkezetében bekövetkező relatíve kicsi változás milyen jelentős hatással lehet a királis felismerés folyamatára. A metilcsoport beépítése révén változik a molekula térkitöltése, H-híd kialakító képessége és az ioncsere folyamatokban fontos szerepet betöltő bázikus karaktere. A kölcsönhatások módosulása révén megváltozhat a szelektorral kialakított diasztereomer komplex stabilitása, illetve képződési sebessége, végső soron megfordulhat az enantiomerek elúciós sorrendje.

Az elúciós sorrend elemzésénél érdemes röviden kitérni a megszokottól eltérő viselkedés tárgyalására is. transz-Paroxetin (142) enantiomereinek elválasztása során ZWIX(+A) és ZWIX(–A) oszlopokon a korábbi tárgyalásnak megfelelően fordított sorrendet, míg ZWIX(+) és ZWIX(–) oszlopokon – meglehetősen váratlan módon – megegyező sorrendet kaptunk. Az enantiomerek viselkedésének feltérképezésére együttműködő partnereink segítségével in silico kísérleteket végeztünk nyolc virtuális enantiomer-szelektor rendszerrel, MeOH/THF (80/20 v/v) eluensben [E11]. Érdekes módon a szimulációval kapott eredmények az elvárásoknak megfelelő elúciós sorrendet jósoltak, de nem voltak összhangban a tapasztalattal. ZWIX(+) oszlopon a (–)-paroxetin enantiomer kisebb REL értéke és a (+)-paroxetinnél erősebb kölcsönhatásra utaló KH értéke alapján (+) < (–) sorrend lenne várható, ellentétben a tapasztalt (–) < (+) sorrenddel.

(A számítás során kapott KH értéke az egyes enantiomerek és az állófázis között kialakuló kölcsönhatás erősségét jellemzi, míg a REL értéke az egyes enantiomerek konformációs energiáját mutatja a minimális konformációs energiához képest.)

A modellezéssel kapott eredmények és a tapasztalt elúciós sorrend eltérése az in silico számítás korlátaira világít rá. Ugyan az általunk alkalmazott modell más, de hasonlónak mondható körülmények között megfelelő jósággal írta le a tapasztaltakat [76, 183], mégis kijelenthető, hogy kisebb enantioszelektivitással jellemezhető elválasztásoknál nem minden esetben ad megfelelő eredményt. Természetesen fontos hangsúlyozni, hogy az összes többi esetben az alkalmazott modell megfelelően írta le a tapasztalt elúciós sorrendet.

Általánosságban elmondható, hogy az ikerionos állófázisok esetén a szelektor mindkét ionos funkciós csoportja részt vehet a királis felismerés folyamatában. Az egyes funkciós csoportok királis felismerésben betöltött szerepe erősen függ az elválasztandó vegyületek szerkezetétől és az alkalmazott körülményektől, így a kialakuló elúciós sorrend a két irányító csoport együttes hatásán keresztül valósul meg. Mivel a kromatográfiás körülmények változtatása nem feltétlenül egyenlő mértékben érinti a felismerés szempontjából meghatározó csoportokat, így a felismerés folyamatában betöltött szerepük és jelentőségük változhat az alkalmazott körülményekkel.

5.1.4. N-Fmoc-védett α-aminosavak sztereokémiai tisztaságának meghatározása