CTAB -dal neutralizált HyA nanorészecskék előállítása és karakterizálása

Jól ismert, hogy a kationos felületaktív anyagok és az anionos M-HyA között kialakuló elektrosztatikus kölcsönhatások révén jól definiált komplex rendszerek állíthatóak elő [59,106]. Annak érdekében, hogy a térhálósított polimerhez hasonló kolloidális komplexeket, mint gyógyszerhordozó rendszereket állíthassunk elő, az általunk felhasznált M-HyA poliszacharidot (Mw= 200-500 kDa) részlegesen és teljesen neutralizáltuk pozitív töltésű CTAB felületaktív anyag segítségével (30. ábra).

30. ábra: A HyA CTAB-dal történő neutralizálásának sematikus ábrája

A M-HyA/CTAB komplex rendszerek kialakítása előtt fontos a poliszacharid-felületaktív anyag közötti elektrosztatikus kölcsönhatások kvantitatív megismerése. A M-HyA neutralizációs tulajdonságait első lépésben konduktometriás és ITC módszerekkel tanulmányoztuk. Előmérésként meghatároztuk a CTAB cmc értékét M-HyA jelenléte nélkül,

Varga Norbert – Ph.D értekezés Eredmények

ahol mind a konduktometriával, mind a ITC -vel hasonló értéket kaptunk (konduktometria:

cmcCTAB= 0,94 ± 0,01 mM; ITC: cmcCTAB= 0,93 ± 0,03 mM) (31.A. és 32.A. ábra). Ezek a szakirodalomban fellelhető adatokkal nagyon jó egyezést mutatnak [137,138]. A méréseket megismételve 0,1 mg/mL koncentrációjú M-HyA oldatban az adott cmc értékek 1,16 ± 0,02 mM -re tolódnak el (31.B. és 32.B. ábra). Az eredményekből megállapítható, hogy a rendszerben lejátszódó folyamatok első lépéseként a negatív töltésű M-HyA poliszacharidot a pozitív töltésű CTAB kb. 1,00:1,00 nCTAB : nHyA,monomer mólarány (0,95:1,00 tömegarány) mellett neutralizálja, melynek befejeződése után a stabilizátor micellaképződése kezdődik el.

31. ábra: (A) M-HyA nélküli és (B) M-HyA tartalmú rendszerekben a CTAB cmc értékének meghatározása konduktometriás módszerrel (cHyA, kezdeti= 0,1 mg/mL) J. Krouská és M. Pekař 10 kDa -tól 1750 kDa molekulatömeggel rendelkező HyA és CTAB/TTAB között kialakuló kölcsönhatásokat már vizsgálták nagyfelbontású ultrahangos spektroszkópiával [139]. A rendszerükön végzett mérések alapján a kritikus aggregációs koncentráció (cac) 1:1 körüli töltési arányok beállta esetében figyelhető meg. Ezt egy későbbi publikációjukkal még inkább megerősítették [140]. Azonban fontos megjegyezni, hogy az eredményeiket cmc feletti koncentrációknál kapták, ahol a micellák képződése jelentősen befolyásolhatja az adatokat. Ennek ismeretében a cac, és ezzel a lineáris HyA ekvivalens töltésének pontos meghatározásához a ITC mérésket kisebb koncentrációjú felületaktív anyag esetében is elvégeztük (cHyA= 0,1 mg/mL, cCTAB= 5 mM). A 32.A. ábrán látható, hogy a CTAB cmc értéke mellett a töltéskompenzálás mértékére meghatározott arányok is jó egyezést mutatnak a konduktometriás adatokkal.

Varga Norbert – Ph.D értekezés Eredmények

32. ábra: Az ITC mérésekből nyert kalorimetriás entalpia görbék (A) 5 mM és (B) 12 mM koncentrációjú CTAB titráló oldatok mellett (T= 25 °C, cHyA,kezdeti= 0,1 mg/mL) (a HyA

nélküli mérést a kék vonal jelzi)

A HyA áttöltését jelző inflexióspont 0,2 ± 0,01 mM koncentrációnál (a konduktometriás mérések esetén ~ 0,16 mM megjelenő változásnál (31.B. ábra)) jelenik meg, ami mólarányok szerint áltagosan 1,2:1,0 értéket jelent. Vizsgálatainkkal megerősítettük, hogy a M-HyA felületaktív anyaggal történő töltéskompenzálás aránya a CTAB koncentrációjával szabályozható.

Az ITC és konduktometriás mérések mellett a M-HyA látszólagos viszkozitását is meghatároztuk állandó nyírósebességen elvégzett reológiai mérésekkel, melyek eredményét a 33. ábra foglalja össze.

33. ábra: M-HyA látszólagos viszkozitási görbéje állandó nyírási sebesség mellett (cHyA, kezdeti= 0,1 mg/mL, cCTAB, titráló oldat= 25 mM)

Varga Norbert – Ph.D értekezés Eredmények

A módszer előnye, hogy a viszkozitáson kívül a vizsgált minta szerkezeti változásait is azonosíthatjuk. A CTAB/M-HyA(monomer) mólarány folyamatos növekedésével a látszólagos viszkozitás értéke fokozatosan csökken. Annak érdekében, hogy a CTAB okozta szerkezeti hatásokat igazoljuk szükséges a rendszer hígulásával korrekciót végezni, ahogyan azt a 33. ábra is mutatja. Az így meghatározott látszólagos viszkozitás értékek szerint, a rendszerben történő szerkezeti változások (feltételezhetően az aggregációs folyamatok) okán, a CTAB mennyiségének növelése mellett megfigyelhető kezdeti csökkenést egy törés szakítja meg, amelyet folytatólagosan már egy lineárisan növekvő szakasz követ. A szakaszokra illesztett egyenesek metszéspontjából meghatározható a M-HyA poliszacharidhoz rendelhető áttöltési pont. A számolások alapján a M-HyA neutralizálás közelítő értékére nCTAB/nHyA,monomer= 1,012 kaptunk, ami a korábbi eredményeinkkel (konduktometria, ITC) jó összhangban van.

A M-HyA/CTAB közötti kölcsönhatások karakterizálását követően a komplex rendszer ζ-potenciálját és hidrodinamikai átmérőjét a mCTAB : mHyA,monomer tömegarány⁴ függvényében tanulmányoztuk (34. ábra), mely során megállapítottuk, hogy a részecskék méretében és stabilitásában történő változások a kalorimetriás és a vezetőképesség mérések eredményeivel jól összevethetőek. A teljes áttöltési pont eléréséig (0,95:1,0 tömegarány) a M-HyA alapú részecskék ζ-potenciálja negatív értéket vesz fel.

34. ábra: M-HyA/CTAB rendszer (A) ζ- potenciál, (B) turbiditás és hidrodinamikai átmérő értékei a mCTAB: mM-HyA,monomer tömegarányok függvényében. A töltéskompenzálás

előtt (mCTAB/mHyA,monomer= 0,2) és után (mCTAB/mHyA,monomer= 0,95) készített minták reprezentatív fotói (B) (cHyA= 0,2 mg/mL, cCTAB= 0,0-0,26 mg/mL, PBS közeg)

4 A korábban alkalmazott nCTAB/nHyA(monomer) mólarányokat azért váltottuk át mCTAB/mHyA

tömegarányokra, mert a CTAB és a HyA egy monomer egységének móltömege közel megegyezik.

Varga Norbert – Ph.D értekezés Eredmények

Efölött a rendszer stabilitása jelentősen lecsökken, amit a turbidimetriás mérések is megerősítenek. A 34.B. ábrán látható, hogy a ~ 0,80 tömegarányig átlagosan 50-130 nm közötti hidrodinamikai átmérő érhető el. Megállapítható továbbá, hogy ~ 0,80 tömegarány felett a rendszerben lejátszódó M-HyA neutralizálásának köszönhetően a hidrodinamikai átmérő 50 nm -ről 750 nm -re nő. A turbiditást nézve a 0,80-0,95 tömegarányok közt jelentős növekedés figyelhető meg, amit a nagyfokú aggregáció miatt kialakuló fázisszeparáció (oldószer fázis/szilárd M-HyA/CTAB aggregátumok) hirtelen lecsökkent. Ebből látható, hogy feleslegben lévő CTAB jelenlétében keletkező részecskék gyógyszerhordozóként való felhasználhatóságát nézve nem optimálisak, így a M-HyA ezen a tartományon nem alkalmazható hordozóként. Eredményeinket összevetve az irodalmi adatokkal megállapítható, hogy átlagosan kisebb mérettel rendelkező részecskéket tudtunk előállítani.

T. Krutišová és munkatársai korábban már vizsgálták a CTAB -ból, illetve MW= 117 és 1670 kDa molekulatömeggel rendelkező HyA -ból felépülő nanorészecskéket, viszont csak 100 nm feletti részecskeméreteket kaptak [141]. T. Pilgrova és M. Pekař munkája során a CTAB/Septonex és HyA ((Mw= 13 kDa, 117 kDa és 1635 kDa) összetételű rendszereket turbidimetriás és DLS módszerekkel tanulmányoztak, ahol azonban a CTAB -dal összevethető szerkezetű Septonex (karbetopendecínium bromid) stabilizátorral és HyA -val (Mw= 13 kDa, 117 kDa) az általunk meghatározottakhoz képest jóval nagyobb, 200 - 500 nm -es részecskéket tudtak előállítani [142].