A citoplazma [Ca 2+ ] növekedése felelős a TRESK aktivációért

A kalcium-mobilizáló hormon receptorok szerteágazó jelátviteli utakat indítanak meg, amelyek közül a két leginkább ismert közvetlen mechanizmus a kalcium felszabadítás az intracelluláris raktárakból inozitol-1,4,5-triszfoszfát (IP3) hatására, illetve a protein kináz C (PKC) konvencionális és ”új-típusú”

(novel) izoformáinak aktiválása diacilglicerin (DAG) által. Mint azonban a TASK-1 példáján is láttuk (2.2.2 fejezet), nem magyarázható minden csatornára kifejtett hatás a citoplazma [Ca²⁺] növekedéssel és PKC aktiválódással.

Kíváncsiak voltunk, hogy a nagyfokú receptor-mediált TRESK aktiválódásért milyen mechanizmus felelős.

Megvizsgáltuk, hogy az IP3 (10 ng) mikroinjektálása a petesejtbe mérés közben milyen hatást fejt ki a TRESK áramra (21. ábra, A panel). Az IP3

injektálás 12.2  1.3-szorosára (n=5) növelte a TRESK áramot, ami arra utal, hogy az IP3 szerepet játszik a receptor-függő TRESK aktivációban [2]. Ha az egér TRESK csatornát kifejező petesejteket a nem-specifikus PKC aktiváló PMA-val (100 nM, phorbol 12-myristate 13-acetate) kezeltük 2-3 percig mérés közben, akkor ez nem változtatta a háttér K⁺ áram nagyságát (nem mutatom).

Az ilyen PMA kezelésről kimutattuk, hogy létrehozza a PKC aktivációt azonos körülmények között a petesejtben (deszenzitizálta az expresszált AT1a

angiotenzin receptort), ezért kijelenthetjük, hogy a gyors receptor-függő TRESK aktiváció (20. ábra) nem a PKC közvetítésével alakul ki. (Nem következik ebből azonban, hogy a PKC nincs hatással a TRESK csatornára. Jóval hosszabb időtartományban (30-60 min) a PMA aktiválja a humán TRESK csatornát, ld.

alább.)

21. ábra: Az inozitol-1,4,5-triszfoszfát (IP3) mikroinjektálása és az extracelluláris oldalról adott kalcium-ionofór ionomycin egyaránt aktiválja a TRESK csatornát A. A két-elektródos voltage clamp mérés közben IP3-at mikroinjektáltunk. Az egér TRESK csatornát kifejező Xenopus petesejtbe szúrtuk a mikroinjektáló kapillárist (hegy beszúrás, üres nyíl), amely egy kis nem specifikus csurgó (leak) áram növekedést okozott. Ezt követően 10 ng IP3-at injektáltunk 50 nl térfogatban, ami kifejezett TRESK áram növekedést eredményezett. A mérés végén az EC [K⁺]-ot 2 mM-ra csökkentettük, a mérés folyamán a nem specifikus csurgó áram nem fokozódott számottevően. B. Az egér TRESK csatornát kifejező petesejtet körüláramoltattuk a 0.5 M ionomycint tartalmazó, magas (80 mM) K⁺ koncentrációjú mérőoldattal (fekete vízszintes vonal a grafikon fölött). A mérés és ábrázolás módja megegyezik a 20. ábrán bemutatottal.

Mindkét panelen reprezentatív regisztrátum látható. Módosítva a [2] közleményből.

Az IP3 legtöbb (de nem minden) hatását a citoplazma [Ca²⁺] növelésén keresztül hozza létre. Ezért az IP3-tól függetlenítve vizsgáltuk a kalcium szerepét a TRESK szabályozásban. Erre egyszerű megközelítést jelentett a kalcium ionofór ionomycin alkalmazása. Az ionomycin (0.5 µM) több petepreparátumban vizsgálva átlagosan 6.2  0.4-szeresre (n=57, 21.B ábra) növelte az egér TRESK áramot. Az ionomycin hatását kivédte, ha magas koncentrációjú EGTA (50 mM, 50 nl) kalcium kelátort mikroinjektáltunk megelőzőleg a petesejtbe (nem mutatom). Mindezek amellett szólnak, hogy a TRESK aktiváció a citoplazma [Ca²⁺] növekedés miatt alakul ki. Mindazonáltal

az ionomycin hatásmechanizmusa aránylag összetett a petesejtben, mert az ionofór elsősorban a belső raktárból szabadít fel kalciumot és csak kisebb mértékben okoz kalcium beáramlást az EC térből [268,269], illetve később az a kép alakult ki, hogy a membránban halmozódó ionofór kismértékű közvetlen TRESK csatorna gátló hatást is kifejt [5]. Egyértelmű viszont az, hogy az ionomycin a receptor ingerlés által elindított komplex jelátviteli mechanizmusoktól függetlenül előidézte a kalcium-függő TRESK aktivációt.

Ezért a későbbi kísérleteinkben az ionomycint rutinszerűen használtuk a kalcium-függő TRESK aktiváció kiváltására.

Szerettük volna a kalcium TRESK szabályozó hatását minél közvetlenebb módon igazolni, ezért megpróbáltuk CaCl2 oldat injektálásával aktiválni a csatornát. A néhány mM-os oldat azonban nem hatott (talán a citoplazma kalcium pufferelő hatása, vagy az intenzív kalcium eltávolító mechanizmusok miatt), magasabb koncentráció pedig elpusztította a sejtet.

Ezért kalciummal telített EGTA puffer mikroinjektálásával aktiváltuk a TRESK csatornát (22. ábra).

22. ábra: A kalciummal telített EGTA mikroinjektálása aktiválja a TRESK csatornát, viszont az EGTA injektálása önmagában kivédi a receptor-mediált TRESK aktivációt. Az egér TRESK csatornát kifejező petesejtek három csoportját mikroinjektáltam Ca²⁺+EGTA+HEPES (50 mM mind, pH 7.3 (KOH)), EGTA+HEPES, vagy HEPES oldatokkal, két-elektródos voltage clamp mérés közben (n=34,

”Injektálás”). A K⁺ áramokat a szokásos módon 80 mM EC [K⁺]-ban mértem, -100 mV-os feszültséglépések végén, 5 percig az injektálást követően. Majd ezután az EGTA+HEPES és HEPES csoportokban a sejteket a koexpresszált M1 muszkarinos acetilkolin receptoron keresztül ingereltem 1 M karbachollal (ahogy ezt a piros vonal jelöli). Az áramokat a kiindulási értékükre normalizáltam és a három csoportra jellemző átlagokat ábrázoltam. A szürke sávok a szórást ( S.E.M.) jelölik. Az oldatokból 50 nl térfogatot injektáltam, ez becslés szerint kb. 10-szeresére hígul a citoplazmában. A HEPES puffer a pH stabilitást biztosította. Módosítva a [2] közleményből.

A Ca²⁺+EGTA+HEPES oldat mikroinjektálása 8.4  1.3-szorosára (n=4) növelte a TRESK áramot 5 perc alatt, hasonlóan nagy mértékben, mint a receptor ingerlés. (Tízszeres hígulással számolva a kezdeti szabad [Ca²⁺]30 µM. Ez 10 µM alá esik, ha a teljes [Ca²⁺] 5-ről 4.9 mM-ra csökken.) Ha az injektált oldat nem tartalmazott Ca²⁺-ot, csak EGTA-t és HEPES-t, akkor az áram nem aktiválódott az injektálás után (1.2  0.1-szeres áram növekedés 5 perc alatt, n=4), és a citoplazma [Ca²⁺] alacsony szintre pufferelése az M1

receptor ingerlés TRESK aktiváló hatását is kivédte (1.2  0.1-szeres további növekedés). Az elmaradt receptor-függő aktiváció nem a mikroinjektálás nem specifikus hatása volt, mivel a csak HEPES pufferrel injektált kontroll oocyták normálisan reagáltak a karbacholra (7.3  0.9-szeres TRESK áram növekedés a 0 perces értékhez képest, n=4, 22. ábra). Így tehát a TRESK aktiválódott a citoplazma [Ca²⁺] emelkedésére a kalcium forrásától függetlenül, viszont a [Ca²⁺] stabilizálása alacsony szinten kivédte a receptor-mediált csatorna aktivációt. Ebből következik, hogy a citoplazma [Ca²⁺] növekedése a TRESK csatorna receptor-mediált aktivációjának szükséges és elégséges feltétele.