A célmembrán felismerése

A membrán-határolt kompartmentekkel zsúfolt citoszolban a fúzióra alkalmas felszíneknek nagy specificitással kell egymást felismerniük. Ebben ismét kis G-fehérjék egy csoportja, az úgynevezett Rab-ok (Ras-rokon fehérjék) játszanak döntő szerepet, amelyek GDP-kötött formájukban a citoszolban vannak, fogva tartják őket

specifikus inhibitoraik. A megfelelő membránban lokalizálódó, és a burokfehérjék távozása után előtérbe kerülő faktorok eltávolítják a gátlófehérjét, majd GEF-jeik aktiválják őket, és ezután a GTP-kötött Rab szintén a membrán citoszolikus felszínéhez rögzül. Ugyanis - a lefűződést segítő kis G-fehérjékhez hasonlóan - ekkor konformáció-változás következtében egy lipidhorgony, a Rab-ok esetében egy C-terminálishoz kapcsolódó prenil-csoport kerül olyan helyzetbe, hogy alkalmassá válik a membránba ékelődésre. Az aktív Rab-ok sokféle folyamatban szerepet játszó fehérjével léphetnek kölcsönhatásba, ezeket gyűjtőnéven Rab-effektoroknak nevezik (11. ábra).

11. ábra) A Rab-okat GDP-kötött, inaktív formában tartják a citoszolban inhibitoraik (GDI: GDP dissociation inhibitor). A GDI-t eltávolító GDF (GDI-displacement factor), majd a GEF (guanine exchage factor) hatására a

Rab GTP-t köt, a membránhoz rögzül prenilcsoportja révén, és sokféle fehérjét (specifikus Rab-effektorokat) toboroz a felszínre, amelyek többek között a megfelelő irányú mozgást és a fúziót is biztosítják.

Emberben eddig körülbelül hetven különböző Rab-fehérjét azonosítottak, ők alkotják a legnépesebb kis G-fehérje alcsaládot.

Fontos megjegyezni, hogy Rab-ok nemcsak vezikuláris felszínen, hanem a megfelelő célmembránon is jelen vannak és szükségesek is a fúzió lebonyolításához. Szelektív jelenlétük az egyes felszíneken nagyban hozzájárul az adott membrán identitásának kialakításához. A Rab-effektorok egyik csoportja a már említett motorfehérjék társasága: a Rab-ok már a szállítás irányát is meghatározzák. A pányvázó (tethering”) fehérjék egy típusa membránban lokalizálódik, hosszú, fonalszerű szerkezeti elemeivel „horgászik” a citoszolban, és egy alkalmas partner-membránban lokalizált aktív Rab-fehérjével interakcióba lépve elősegíti a megfelelő vezikula dokkolását (12. ábra).

12. ábra) A vezikulák célmembránhoz történő dokkolását pányvázó fehérjék segítik, amelyek felismerik és kölcsönhatást alakítanak ki a megfelelő vezikula-specifikus fehérjével (itt: egy Rab-bal). A kísérő ábrán egy ismert pányvázó fehérje (EEA1: early endosomal antigen1) szerkezete látható. A pányvázó fehérjék megfelelő közelségbe hozzák a vezikula felszínén található v-SNARE-t és a célmembrán t-SNARE fehérjéit (lásd még: 13.

ábra)

Rab-ok szükségesek a fúziót lebonyolító SNARE-k működéséhez is (lásd később).

Az aktivált Rab saját GEF-jeit is odatoborozhatja maga köré, ily módon újabb és újabb Rab-ok csoportosulnak a membrán egy területére. Miután ugyanaz a Rab-fehérje többféle effektorral léphet kapcsolatba, és az egyes interakciók pozitív visszacsatolások következtében sokszor erősítik további kölcsönhatások létrejöttét, a membrán felszínén egy-egy foltban igen gyorsan összegyűlhetnek és aktiválódhatnak az adott fúzióban szerepet játszó effektorok. Sőt, sok esetben egy (nagyobb) kompartment membránjának különböző területein eltérő összetételű foltok alakulhatnak ki, különböző irányból érkező vezikulák fogadásához és indításához.

A sikeres fúzió után, „dolguk végeztével” a Rab-ok (GAP-ok támogatásával) hidrolizálják GTP-jüket, szerkezetük átalakul, prenil-oldalláncuk kiszabadul a membránból és újra a citoszolba kerülnek. Ott inhibitoraikkal kapcsolódva mindaddig inaktívak maradnak, míg specifikus GEF-jükkel kölcsönhatásba lépve egy újabb ciklusba nem kezdhetnek.

4.2. A fúzió folyamata

A membránfúziót a már többször említett SNARE-k bonyolítják le, amelyek mechanikai szerepükön kívül részt vesznek a megfelelő donor-és célmembrán azonosításában is. Ezzel összefüggésben szintén népes fehérjecsaládról van szó: több, mint hatvan tagját izolálták eddig. A vezikula membránjában a v-SNARE-k, a célmembránban pedig komplementer partnereik, a SNARE-k lokalizálódnak. A v-SNARE-ket egyetlen, a t-SNARE-ket két vagy három polipeptidlánc alkotja. Bár szerkezetükben, méretükben eltérhetnek, a citoszolba nyúló doménjük (SNARE-motívum) hasonló: 60-70 speciális elrendeződésű, hidrofób és töltött aminosavból álló α-hélixet képez. Ha a komplemeter v- és t-SNARE-k egymás fizikai közelségébe kerülnek (ok és Rab-effektor pányvázó fehérjék interakciója következtében, lásd 12.ábra), α-hélixeik egy stabil hármas vagy négyes köteget, a transz-SNARE komplexet hozzák létre (13. ábra).

13. ábra. A v-SNARE és a t-SNARE-k stabil komplexet alakítanak ki, megfelelő közelségbe hozva így a vezikula és a célmembrán lipidrétegeit.

Ebben döntő szerepet játszik egy-egy töltött aminosav (a v-SNARE-n egy pozitív töltésű arginin, a t-SNARE-ken egy-egy negatív töltésű glutamin), valamint a környező hidrofób aminosavak, amelyek leucin-cipzár-szerű struktúrát alkotnak.

Az α–hélixek feltekeredése olyan közelségbe hozza a két membránfelszínt, hogy még a vízmolekulák is kiszorulnak a két lipidréteg közül. Ekkor egyes lipidmolekulák átvándorolhatnak egyik citoszolikus lipidrétegből a másikba, és még részleteiben nem teljesen tisztázott módon a két membrán egyesül (14. ábra).

14. ábra. A membránfúzió lehetséges lépései. 1. A két lipid kettősréteg megfelelő közelségbe kerül. 2. Az egymással szemben levő (cisz) felszínek fúziójával kialakul egy „szár” - ezt az állapotot hemifúziónak nevezik.

3. A „szár” kiterjed, a transz felszínek is kontaktusba lépnek; hemifúziós diafragma jön létre. 4. A diafragma átszakad és a két membrán egyesül.

A transz-SNARE komplex létrejötte energetikai szempontból rendkívül kedvező, olyannyira, hogy önmagában biztosítja azt a nem kevés energiát, amely a membránok fúziójához szükséges. In vitro kísérletekben komplementer v- illetve t-SNARE-kat a felszínükön hordozó liposzómák Rab-ok és effektoraik hiányában ugyan lassan, de végül spontán módon fuzionálnak.

Ahhoz, hogy a SNARE-k közötti interakció jó helyen és jó időben jöjjön létre, a Rab-ok is hozzájárulnak. A t-SNARE-k sokszor gátlófehérjéhez kötődnek a célmembránban, és csak a megfelelő Rab-ok vagy effektoraik képesek ezt feloldani. Így aktív t-SNARE-k csak a membránfelület azon részein vannak jelen, ahol a közvetlen közelben fúzióra váró vezikulák tartózkodnak.

A fúzió azonos identitású membránok között is bekövetkezhet, erre mind a szekréció során (például ER-ből lefűződő vezikulák), mind az endocitózis során (például az endocitotikus vezikulák fúziója korai endoszómává) sokszor sor kerül. Ekkor azonos v-, illetve a nekik megfelelő t-SNARE-komplexek találhatóak mindkét membránfelszínen, szimmetrikusan. Ez a folyamat a homotipikus fúzió, míg az eltérő kompartmentek között heterotipikus fúzió jön létre.

A fúzió nem mindig következik be a komplementer SNARE-k interakciója után. A szabályozott szekréció esetében a befejezéshez egy külső jel is szükséges. A legtöbbet tanulmányozott membránfúziós esemény, a szinaptikus vezikulák exocitózisa során egy részlegesen összeszerelődött transz-SNARE komplex jön létre, a fúzió befejeződéséhez pedig a külső jelet az axon-terminálison bekövetkező Ca²⁺-beáramlás biztosítja, amely az exocitózishoz szükséges Ca²⁺-függő fehérjéket aktiválja (9. fejezet 14. ábra).