Biolumineszcencia rezonancia energiatranszfer mérések

4.4.1. A BRET-alapú mérések elve

A BRET a fehérje-fehérje interakciók (intermolekuláris BRET) és a fehérjén belüli konformációs változások (intramolekuláris BRET) követésére alkalmas módszer.

A BRET mérésekben donorként valamilyen biolumineszkáló molekula szerepel, míg akceptorként bármilyen fluoreszcens anyag megfelel, ha annak excitációs spektruma átfed a biolumineszcenciából eredő fény emissziós spektrumával [182]. Donorként leggyakrabban a Renilla reniformis virágállatokból származó luciferáz enzimet alkalmazzák, de más, méretében és/vagy spektrális tulajdonságaiban eltérő luciferázt is sikerrel használtak már [277, 278]. A Renilla luciferáz a cölenterazin h szubsztrátot hasítja cölenteramiddá, amely reakció ~480 nm emissziós maximummal rendelkező fény emisszióját idézi elő. Ideális BRET akceptor a sárga fluoreszcens fehérje (YFP) vagy annak fényesebb és monomer természetű változata, a Venus, melyek gerjesztés hatására

~530 nm emissziós maximumú fényt bocsájtanak ki. A BRET jelensége csak akkor lép fel, ha a BRET donor és akceptor molekuláris szintű közelségben helyezkednek el [182].

A BRET mértéke függ a donor és az akceptor közötti távolságtól és az orientációtól, a BRET a távolság változására kifejezetten érzékeny, mértéke fordítottan arányos a távolság negyedik hatványával. A fehérje-fehérje interakciók BRET módszerrel való követéséhez általában luciferázzal és fluoreszcens fehérjével fuzionáltatott proteineket fejeztetnek ki sejtekben, és a létrejövő BRET alapján következtetnek a megjelölt proteinek közötti interakcióban bekövetkezett változásokra. A megjelölt fehérjék közötti molekuláris kapcsolat esetén nagyfokú BRET jön létre, míg interakció hiányában a BRET lecsökken [182].

Az Aequorea victoria GFP-eredetű fluoreszcens fehérjék nagy hátránya a viszonylag nagy méretük (~29 kDa) [182]. A jelölni kívánt fehérjék gyakran jól tolerálják, ha N- vagy C-terminálisukhoz fuzionáltatják őket, viszont a fehérjén belüli jelölés nagyon sokszor kivitelezhetetlen a funkció sérülése nélkül. Ennek kiküszöbölésére fejlesztették ki a FlAsH jelölést [279]. A FlAsH-EDT2 molekula egy fluoreszcens festéket (fluoreszceint) és ahhoz egy-egy arzénen keresztül kapcsolódó etán-ditiol (EDT) csoportot tartalmaz. A FlAsH-EDT2 utóbbiak segítségével képes 4 egymáshoz közel található cisztein tiol-tartalmú oldalláncaihoz kapcsolódni. Ezáltal, ha egy meghatározott rövid aminosavmotívumot (például CCPGCC) építünk be egy fehérjébe, képesek

64

vagyunk azt a FlAsH-EDT2 segítségével fluoreszcensen megjelölni. Így a teljes jelölés mérete mindösszesen ~1,2 kDa, ami valószínűsíthetően kevésbé módosítja az akceptorral megjelölt protein működését. A módszer további előnye, hogy a FlAsH-EDT2 molekula csak a peptidhez történő kötődés után válik fluoreszcenssé [280]. Ha az akceptorral megjelölt protein egy luciferáz enzimet is tartalmaz, akkor információt kaphatunk a molekulán belüli strukturális átrendeződésekről (konformációváltozásokról) a BRET követésén keresztül.

Mint ahogy a 2.3.3.1. fejezetben már említettem, a BRET nemcsak specifikus kötödésből, hanem két molekula véletlenszerű ütköződéséből is létrejöhet. Utóbbit aspecifikus BRET-nek vagy „bystander BRET”-nek nevezzük. Munkacsoportunk Monte-Carlo szimulációk segítségével és kísérletesen is kimutatta, hogy a bystander BRET mértéke (ugyanazon membránon elhelyezkedő donor és akceptor esetén) csak az akceptor mennyiségétől függ, míg specifikus interakció esetén a BRET nagyságát az akceptor és a donor mennyisége is meghatározza [183].

A bystander BRET sokszor megnehezíti a specifikus és nem specifikus interakciók elkülönítését, ezért a megfelelő kontrollok elengedhetetlenek az eredmények körültekintő kiértékeléséhez. A bystander BRET jelenségét azonban ki is használhatjuk egy fehérje sejten belüli kompartmentváltásának követésére. Például a bystander BRET mértékének mérésével követhetjük a receptorstimuláció hatására létrejövő β-arresztin transzlokációt a plazmamembránhoz [281, 282]. Ehhez a plazmamembránt akceptorral, a β-arresztint pedig donorral jelöljük meg, és ezek mellett a sejtekben nagymennyiségű jelöletlen receptort is expresszáltatunk. A receptorkötés hatására az addig diffúzan citoplazmatikusan elhelyezkedő β-arresztin feldúsul a plazmamembrán mentén, így megnő a bystander BRET a donor-jelölt β-arresztin és az akceptor-jelölt plazmamembrán között.

4.4.2. A BRET mérések kivitelezése

Valamennyi BRET mérést 37 °C-on és letapadt sejteken végeztük. A sejtek médiumát egy mosási lépést követően módosított Ringer oldatra (120 mM NaCl, 10 mM glukóz, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 0,7 mM MgSO4, pH 7,4) cseréltük. Intermolekuláris BRET-et (vagy intramolekuláris BRET-et EPAC és Cameleon D3 Ca²⁺ BRET szenzorok esetében) Renilla luciferáz (Rluc, Sluc vagy Rluc8)

65

és YFP- vagy Venus-jelölt fehérjék között mértünk. Minden mérést a fluoreszcens fehérje expressziójának meghatározásával kezdtük, amire a fluoreszcencia mértékéből következtettünk. A fluoreszcenciát 535 nm-es hullámhosszon mértük 510 nm-es excitáció mellett Thermo Scientific Varioskan Flash multimode plate reader készülékkel. A BRET követéséhez mértük a fényintenzitást 530 és 480 nm-es filterek segítségével a luciferáz szubsztrát cölenterazin h (5 µM) adása után, a BRET titrációs kísérletek és a mutáns donor-jelölt konstrukciók expressziójának vizsgálata során meghatároztuk a teljes lumineszcenciát is filter használata nélkül. Minden kísérletet duplikátumban vagy triplikátumban végeztünk el.

Mivel a biolumineszcencia lecsengő tendenciát mutat (a luciferáz szubsztráthasításából adódó „öngyilkos” inaktivációjának következtében [283]), ezért a BRET követésére a BRET hányadost képeztük, ami az akceptor emissziós maximumán mért fényintenzitás osztva a donor emissziós maximumán mért fényintenzitással (I530nm/I480nm). Tekintettel arra, hogy a kiindulási BRET hányados függ a BRET partnerek expressziójának mértékétől, sokszor informatívabb volt a BRET hányados stimulus hatására létrejövő változásának (ΔBRET jel) meghatározása.

Az Rluc8-β-arresztin2-FlAsH szenzorok intramolekuláris BRET jelének követéséhez egy korábban leírt jelölési protokollt alkalmaztunk 96-lyukú tenyésztőlemezes mérésekhez [280]. Elsőként 1 mM FlAsH-EDT²-t szobahőn inkubáltunk 12,5 mM EDT-vel 5 percig, hogy minden FlAsH molekula FlAsH-EDT2

formában legyen. A sejteket kétszer mostuk módosított Ringer oldattal. Ezután a sejteket 500 nM FlAsH-EDT2-vel jelöltük 12,5 µM EDT és 0,1% dimetil-szulfoxid (DMSO) jelenlétében (módosított Ringer oldatban) 1 óráig szobahőn. Ezután a felesleges és aspecifikusan kötődő FlAsH festék eltávolításához a médiumot 250 µM EDT tartalmú Ringer oldatra cseréltük 10 percig, majd a sejteket háromszor mostuk módosított Ringer oldattal. Ezután ugyanazt a mérési protokollt követtük, mint az intermolekuláris BRET kísérletek esetében. Az intramolekuláris BRET-et a szenzor Rluc8 és FlAsH jelölése között mértük.

Mivel az intramolekuláris β-arresztin2 BRET szenzorok jelváltozásának nagysága függ attól, hogy a szenzormolekulák mekkora hányada aktiválódik (köt receptort), ezért relatív FlAsH jelet határoztunk meg: az intramolekuláris BRET hányados változását az

66

intermolekuláris BRET hányados változására normalizáltuk. Az intermolekuláris BRET-et az Rluc8-jelölt szenzor és Venus-jelölt receptor között mértük párhuzamos kísérlBRET-etben.