3. Eredmények és diszkusszió
3.3 A bFcRn -láncot kifejező BAC Tg egérmodellek előállítása és jellemzése
3.3.7 A bFcRn -láncot kifejező BAC Tg egerek humorális immunválaszának diverzitás
49. ábra – A bFcRn Tg és vt egerek humorális immunválasz diverzitásának elemzését olyan microarray (A) rendszerben teszteltük, amelyre az ovalbumin fehérjét alkotó 95 db. átfedő oligopeptidet konjugáltuk (B). Az egyes epitópot/peptidet felismerő egér IgM vagy IgG ellenanyagot fluoreszceinnel jelölt másodlagos ellenanyagokkal detektáltuk (Vegh et al., 2012).
dc_497_12
A fokozott mértékű humorális immunválasz, ill. ezen belül is a megnövekedett Ag-specifikus IgM szint, illetve a fokozott számú Ag-Ag-specifikus IgM-típusú ellenanyagokat termelő sejtek arra utaltak, hogy a Tg egerek másodlagos nyirokszerveiben intenzívebb a naiv B-limfociták aktiválódása, ami a B-sejt klónok számának fokozásával és ezáltal az ellenanyag repertoár diverzitásának növelésével jár. Ezt a feltevésünket úgy teszteltük, hogy Tg és vt egereket (15 állat/csoport) ovalbuminnal oltottunk, és az immunizálást követően az egyes egerek szérumát egy olyan microarray rendszerben teszteltük, amelyre az ovalbumin fehérjét alkotó 95 db átfedő oligopeptidet konjugáltuk. Az egyes peptidekhez kapcsolódó egér IgM és IgG ellenanyagot fluoreszcein-jelölt másodlagos ellenanyagokkal detektáltuk (49. ábra).
Vizsgálatunk kimutatta, hogy mind a Tg, mind a vt egerek széruma több ovalbumin epitóppal is reagáló ellenanyagot is tartalmazott az immunizálás 49. napján. A peptid specifikus IgM ellenanyagok esetén megállapítható volt, hogy a Tg egerek sokkal több epitópot ismertek fel, mint a kontrollok. Ennek magyarázata lehet, hogy a Tg állatokban sokkal nagyobb számú naiv B-sejt aktiválódik és válik IgM termelő plazmaB-sejtté az immunválasz során, mint a vt egerekben.
Ezzel szemben nem találtunk számottevő különbséget a peptid specifikus IgG ellenanyagok esetén, hiszen mindkét csoport egyedei szinte ugyanazokat az epitópokat ismerték fel, bár a Tg állatokban termelődött mennyiségük jelentősen meghaladta a kontrollokét (50. ábra) (Vegh et al., 2012).
Korábbi publikációkból jól ismert, hogy az immunrendszer sokféle B- és T-sejt epitópot képes felismerni, de végül is csak néhánnyal, az ún. immundomináns epitópokkal szemben alakul ki hatékony immunválasz. Ismert továbbá az is, hogy ez a fajta elköteleződés az IgM→IgG izotípus váltáskor következik be és csak az IgG termelő B-sejt populációt érinti (Agarwal et al., 1996). Amennyiben egy adott antigén immundomináns epitópjait eltávolítják, akkor az antigén más epitópja ellen is hatékony immunválasz alakul ki (Garrity et al., 1997; Tobin et al., 2008;
Henry et al., 2011). Mindezek arra utalnak, hogy bár a Tg egerek többféle naiv B-sejtet aktiváltak (azaz a Tg állatokban szinte minden epitóp ellen alakult ki IgM ellenanyag), azok közül csupán az OVA immundomináns epitópjaira specifikus B-sejtekben játszódott le az IgM→IgG izotípusváltás (Vegh et al., 2012).
dc_497_12
50. ábra – a Tg egerek sokkal nagyobb mértékű diverzitást mutatnak az IgM izotípusú ellenanyagokat elemezve, míg az IgG izotípusú ellenanyagok esetén nem mutatkozik különbség a felismert epitópok számát tekintve a Tg és vt egerek között az immunválasz 49.
napján (Vegh et al., 2012).
dc_497_12
3.3.8 A bFcRn -láncot kifejező BAC Tg egerek humorális immunválaszának elemzése – konjugált haptén (TNP-KLH) immunizálással
A bFcRn Tg egerek immunválaszának további karakterizálásához hordozóhoz kötött haptén típusú TNP-humán IgG (TNP-hIgG) konjugátummal oltottunk FVB/N_Tg4 és FVB/N_vt állatokat. Az OVA immunizáláshoz hasonlóan, a haptén-specifikus IgM és IgG ellenanyagok titere és a totál IgG mennyisége is sokszorosan (8-10-szer) magasabb volt a Tg állatok szérumában, mint a vt állatokéban (51. ábra).
51. ábra – bFcRn Tg egerekben TNP-hIgG immunizálás hatására is erőteljesebb immunválasz alakul ki, mint a vad típusú állatokban. FVB/N_vt és FVB/N_Tg4 egereket immunizáltunk i.p. TNP37-huIgG + CFA adjuvánssal, majd a 14. és 28. napon megismételtük az oltást IFA adjuvánssal. A szérumok IgG és IgM szintjét ELISA módszerrel határoztuk meg. (A) TNP-specifikus IgG titer (B) TNP-specifikus IgM titer. A szignifikancia szintek a vt és tg állatok azonos időpontban mért értékei közötti különbségre utalnak. A grafikonon feltüntetett pontok három mérés átlagát ± SEM mutatják (***, p < 0.001). (Cervenak et al., 2011)
Annak bizonyítására, hogy a bFcRn Tg állatok fokozott immunválasz képessége nem egértörzs-függő, az FVB/N genetikai hátterű, a bFcRn-t 5 kópiában hordozó Tg állatokat BALB/c törzs egyedeivel kereszteztük 10 nemzedéken át, és létrehoztunk egy kongenikus BALB/c bFcRn tg egértörzset (BALB/c_Tg5) (kongenikus vonal, amely a BALB/c genotípustól mindössze az integrált transzgén és az ahhoz kapcsolódó kisebb génszakasz vonatkozásban különbözik (Flaherty, 1981)). Ezeken az állatokon megismételtük a TNP-hIgG immunizálást és az előzőekhez hasonlóan meghatároztuk a TNP-specifikus és a totál IgG szintet a szérummintákból. Az FVB/N állatok TNP-hIgG immunizálásához hasonlóan, a haptén-specifikus IgG ellenanyagok titere és a totál IgG mennyisége a BALB/c hátterű Tg egerek esetében is mintegy tízszerese volt, mint a velük azonos genetikai hátterű vt állatokéban (Cervenak et al., 2011).
0 20 40 60
0 5000 10000 15000 20000 25000
immunizálás
*** *** ***
idő (napok)
***
***
***
FVB/N_vt FVB/N_tg4
anti-TNP IgG (titer)
0 20 40 60
0 100 200 300 400
immunizálás
*** ***
***
idő (napok)
anti-TNP IgM (titer)
A B
dc_497_12
A vt és Tg állatokban termelődő ellenanyagok affinitásának összehasonlítása továbbra is központi kérdés volt számunkra. A TNP specifikus ellenanyagok affinitását egyfelől egy olyan ELISA rendszerben vizsgáltuk, amelyben az ellenanyagok kétféle, egy alacsony és egy magas haptenáltsági fokú TNP-IgY konjugátumhoz való kötődését tudtuk elemezni (Herzenberg et al., 1980). A TNP4/TNP42 kötődési arány alapján megállapítottuk, hogy mindkét állatcsoport szérumában jelen vannak a magas affinitású ellenanyagok, szignifikáns különbséget azonban nem láttunk a két állatcsoport között.
A TNP-specifikus szérum IgG tartalom és az ellenanyagok affinitásának további összehasonlítását az IgG molekulák kötődési sebességi állandóinak meghatározásával folyadék-áramlásos Quartz Crystal Microbalance (QCM) módszerrel végeztük, Dr. Liliom Károly (MTA Enzimológiai Intézet, Budapest) segítségével. Elemzéseink során nagyon erős kötődést tapasztaltunk mindkét állatcsoportból származó IgG molekulák esetében. A vt és Tg állatok TNP-specifikus IgG molekuláinak átlagos asszociációs és disszociációs sebességi állandói és így az egyensúlyi disszociációs konstans értékei között sem volt szignifikáns különbség. A Tg állatok szérumaiban lévő TNP-specifikus IgG molekulák koncentrációja azonban mintegy 3-szoros volt a vad típushoz képest még úgy is, hogy azonos mennyiségű IgG-t fecskendeztünk a chipre (52. ábra) (Cervenak et al., 2011).
A nagy affinitású ellenanyagok jelenléte azt is mutatta, hogy mind a vt, mind a Tg állatokban megfelelően lezajlott az affinitás érés folyamata.
Egér vonal
kon (M-1s-1) koff (s-1) KD (nM)
Mmax
Tg 2,6x105 4,3x10-4 1,7 19,5
vt 2,5x105 6,5x10-4 2,6 6,9
52. ábra - vt és bFcRn Tg állatokból származó TNP-specifikus IgG molekulák valós idejű kötődési kinetikája QCM módszerrel követve. Mindkét állatcsoport esetén nagy affinitású kötődést tapasztaltunk, melyet magas kon és alacsony koff érték jellemez (táblázat). Az egyensúlyi disszociációs konstans értékek között szignifikáns különbséget nem tapasztaltunk, de a Tg állatokból származó mintában a TNP-specifikus IgG molekulák koncentrációja 3-szor magasabb volt, mint a vt állatokéban (táblázat, Bmax) (Cervenak et al., 2011).
dc_497_12
3.3.9 A bFcRn -láncot kifejező BAC Tg egerek humorális immunválaszának elemzése – gyengén immunogén antigénekre adott immunválasz
Vizsgálataink azt mutatták, hogy a bFcRn Tg állatok - egértörzstől függetlenül – lényegesen hatékonyabb és nagyobb mértékű immunválasszal reagálnak, mint a vad típusú kontrollok. Mivel mind az OVA, mind a TNP-fehérje konjugátum erősen immunogének az egerek szervezetében, a továbbiakban egy gyengén immunogén antigénnel teszteltük az állatok immun válaszképességét.
Az univerzális influenza vakcina kutatás igen nagy érdeklődést váltott ki az elmúlt években. Ekiert és mtsai leírták, hogy egy H1N1 influenza vakcinázott ember vér B-sejtjeiből készült fág-könyvtár segítségével olyan immunglobulint izoláltak (CR6261), amely az influenza hemagglutinin 2-es alegységének (HA2) α-hélixét ismeri fel (53. ábra). Kimutatták továbbá, hogy ez az ellenanyag szinte valamennyi influenza törzs fertőzőképességét megakadályozza in vitro rendszerben és in vivo állatkísérletekben is („univerzális influenza vakcina jelölt epitóp”).
A szerzők megjegyezték ugyanakkor, hogy az azonosított HA2 epitóp nagyon gyenge immunogenitással rendelkezik (Ekiert et al., 2009), amelyet saját antigénpredikciós elemzéseink is alátámasztottak. Az adott epitóp egy 17 aminosav maradékból álló szakasz (TQ NAI NGI TNK VNS VIE), amely a Kolaskar és Tongaonkar predikció szerint (Kolaskar and Tongaonkar, 1990) a C terminális részen lehet kismértékben immunogén, míg a komplexebb Bepipred Linear Epitope Prediction analízis (Larsen et al., 2006) nem mutatott benne potenciális B-sejt epitópot. A peptidet KLH-hoz konjugáltuk, majd BALB/c_vt és BALB/c_Tg5 állatokat immunizáltunk a konjugátummal. Míg a vt állatokban alig termelődött peptid-specifikus ellenanyag, a Tg állatok szérumából magas titerű anti-peptid IgG (54. ábra) és IgM választ tudtunk kimutatni.
A KLH-specifikus IgG és IgM ellenanyag titer a Tg állatokban 3-szor magasabb volt a kísérlet végén, mint a vt állatokban, de a vt állatokban mért titer értékek is megfelelő immunválaszra utaltak. Az immunizálás 50. napján elemeztük az állatok lépsejt összetételét. Az korábbi eredményekhez hasonlóan, a Tg állatok lépe kétszer nagyobb volt, mint a vt állatoké. A sejtarányokat a lépsejtszám ismeretében B-, T- stb. sejtszámra váltottuk, és így hasonlítottuk össze a két állatcsoportot. Legnagyobb mértékben most is a granulociták
FabCR6261 H A 1
HA 2
membrán
53. ábra – a CR6261 Fab interakciója az influenza HA2 alegségével (Ekiert et al., 2009).
10 20 30 40 50
0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000
wt bFcRn Tg
ELISA titer
immunizálás idő (nap)
FLU HA2 peptid specifikus IgG titer
54. ábra - KLH-hoz konjugált HA2-peptid csak a Tg állatokban váltott ki megfelelő immunválaszt (Vegh et al., 2011).
dc_497_12
átesett plazmasejtek száma is jóval nagyobb a bFcRn Tg állatokban, mint a vt kontrollokban (Vegh et al., 2011).
3.3.10 A bFcRn -láncot kifejező BAC Tg egerek humorális immunválaszának elemzése – FITC-dextrán immunizálással
A bFcRn molekula T-independens immunválaszra gyakorolt hatásának vizsgálatára a TI2-es típusú antigénekhez tartozó poliszacharidhoz kapcsolt haptén molekulával, FITC-dextránnal oltottunk FVB/N_vt és FVB/N_Tg4 egereket és meghatároztuk a haptén-specifikus IgG és IgM titereket. A T-dependens antigén stimulussal ellentétben, ebben az esetben az antigén-specifikus IgM titerben nem tapasztaltunk különbséget. A Tg egerek széruma szignifikánsan több FITC-specifikus IgG-t tartalmazott, mint a vt egereké, bár a FITC-FITC-specifikus IgG titer mindkét állatcsoportban nagyon alacsony volt (55. ábra).
55. ábra - A T-independens, FITC-dextrán immunizálás hasonló immunválaszt váltott ki a Tg és vt egerekben. (A) A Tg egerek széruma több FITC-specifikus IgG-t tartalmazott, mint a vt egereké, bár a FITC-specifikus IgG titer mindkét állatcsoportban nagyon alacsony volt. (B) A FITC-specifikus IgM válasz hasonló volt mindkét állatcsoportban. A grafikonon feltüntetett pontok három mérés átlagát ± SEM mutatják (*, p < 0.05; **, p < 0.01***; p < 0.001) (Cervenak et al., 2011).
0 7 14 21 28 35 42 49 56 0
10000 20000 30000 40000
immunizálás
idő (napok)
anti-FITC IgM (titer)
0 7 14 21 28 35 42 49 56 0
1000 2000 3000 4000 5000
immunizálás
***
*** **
**
*
idő (napok)
FVB/N_vt FVB/N_Tg4
anti-FITC IgG (titer)
A B