BCV1 dsRNS1 (RdRp) szekvencia meghatározása

A BCV1 RdRp-t kódoló szegmenséről Natalya Enünlü kísérleteiből már álltak rendel-kezésemre szekvenciaadatok. Mivel a szekvencia 5’- és 3’-végei hiányoztak, és más fajtából izoláltuk a BCV1 dsRNS-eket, a teljes szekvencia klónozását és jellemzését elvégeztük.

Az iniciális cDNS szintézist random primerekkel (UNRH) indítottuk (Choi és mtsai., 1999), melyhez CF-11 oszlopkromatográfiával tisztított és DNáz I és RNáz A enzimekkel kezelt ~2000 bp nagyságú dsRNS1 molekulát használtunk templátként (17. ábra). A random primerekkel nyert klónok (A194/11, A195/6, A195/28, A193/7/1, A194/4, A189/1, A194/16, A193/4/1 és A193B/10/1) összeillesztéséből egy 1484 nt hosszúságú contigot hoztunk létre (19. ábra), amely 99 %-ban azonosnak bizonyult a Natalya Enünlü által meghatározott szekvenciarészlettel. Az újonnan meghatározott szekvencia mindössze 12 nukleotid eltérést

tartalmazott, amely hat esetben aminosavak cseréjét is eredményezte, az egyik aminosav csere az RNS-függő RNS-polimeráz 5. konzervált motívumát is érintette.

Az 1484 bp hosszúságú contiggal elvégzett szekvencia összehasonlítások rendkívül ér-dekes eredményt hoztak. Azt találtuk ugyanis, hogy a BCV1 dsRNS1 parciális szekvenciája feltűnően hasonló (78 és 75 %) a pillangós virágú növényekből izolált White clover cryptic virus (AY705784), valamint és Vicia cryptic virus RNS-függő RNS-polimerázt kódoló dsRNS1 szegmenseihez (Boccardo és Candresse, 2005a; Blawid és mtsai., 2007). A Natalya Enünlü kísérleteiből szárazó részleges eredmények több évvel megelőzik a WCCV1 és VCV dsRNS1 szekvenciák publikálását, ez az oka annak, hogy csak a kísérletes munka folytatása közben derült fény e vírusok közötti fennálló hasonlóságokra (Enünlü és mtsai., 2003).

A BCV1, VCV és WCCV1 dsRNS1-ek között meglévő nagyfokú hasonlóságot felhasz-náltuk a klónozási munka folytatásához. Arra a feltételezésre alapoztunk ugyanis, hogy a dsRNS1 5’, illetve 3’ nem transzlálódó végei esetében is a belső régióknál már megfigyelt mértékű hasonlóságot találjuk. Az adatbázisban elérhető VCV és WCCV1 homológ dsRNS1 szekvenciái alapján primereket terveztünk az 5’ és 3’ nem transzlálódó régiókra, valamint az ORF kezdeti szakaszaira (5’ UTR forward primer: NP66; 3’ UTR reverz primer: NP68 és az ORF kezdeti szakaszaira NP67 forward primer). A VCV és WCCV1 dsRNS1-specifikus pri-merek mellett BCV1 dsRNS1-specifikus pripri-mereket is használtunk a cDNS szintézis és a PCR (A297 [NP67-NP04]; A298 [NP68-NP04]; A299 [NP05-NP68] és A340 [NP26-NP68]

jelöléssel) során. A klónozott PCR termékek szekvenálását követően egy 1949 bp hosszúságú contigot alakítottunk ki.

A dsRNS1 5’-, ill. 3’-végek pontos meghatározása nem bizonyult egyszerű feladatnak, és csak a dsRNS molekulák 3’ végeinek polyA-polimerázzal való jelölésével tudtuk elérni a kívánt eredményt. Ugyanezt a jelölést használták Xie és munkatársai a BCV3 dsRNS2 szek-vencia meghatározásánál (Xie és mtsai, 1993) is. A cDNS szintézist és a PCR-t a polyA sza-kaszra tervezett oligo(dT) primerrel és dsRNS1-specifikus belső primerekkel hajtottuk végre (A309 [oligo(dT)-NP04]; A310 [NP05- oligo(dT)] jelöléssel).

19. ábra: A BCV1 dsRNS1 szekvenciájának meghatározására szolgáló független cDNS-klónok elhelyezkedése. A cDNS-cDNS-klónok zömét a UNRH random primereket hasz-nálva nyertük. A hiányzó 1674–1809 bp közötti régiót BCV1-specifikus primerek, az 5’- illetve 3’-végeket oligo(dT), valamint a VCV és WCCV1 dsRNS1-ből leve-zetett primerek segítségével előállított klónokból határoztuk meg. Az ábrán a klón jelölésén kívül a lefedett szekvencia régiót is megadtuk. Minden levezetett szek-vencia legalább két független klón szekvenciáján alapul és a klónok átfednek.

A BCV1 dsRNS1 teljes szekvenciáját húsz egymással átfedő, független cDNS-klónból határoztuk meg (19. ábra). A dsRNS1 szekvencia minden részletét legalább két egymástól független klónnal erősítettük meg. Azokban az estetekben, ahol a párhuzamos klónok szek-venciái eltértek egymástól (ez huszonöt nukleotid esetében fordult elő) további független kló-nokat szekvenáltattunk és használtunk fel a végleges nukleotid sorrend kialakításához.

A BCV1 dsRNS1 2008 nt hosszúságú (20. ábra), a molekulát felépítő nukleotidok gua-nin-citozin (GC) tartalma 46 %-os. A szekvencia számítógépes analízise során a dsRNS1 po-zitív szálán egy 1851 nt hosszúságú ORF-t azonosítottunk. A negatív szálon nem találtunk nyílt leolvasási keretet. Az azonosított ORF start kodonja, az AUG a 94-96, az UAA stop kodon pedig az 1942-1944 pozícióban helyezkedik el (20. ábra).

20. ábra: A BCV1 dsRNS1 pozitív szálának nukleotid szekvenciája és az ebből levezetett fehérje szekvencia. A BCV1 dsRNS1 2008 nt, egyetlen nyílt leolvasási kerete egy 616 aminosav hosszúságú fehérjét kódol. Az 5’ (93 nt) ill. 3’ (64 nt) nem transzlálódó régiók ezt az ORF-t szegélyezik.

Az 5’ nem transzlálódó régió (5’ UTR) 93 nukleotid hosszú és az 5’-GAU CAA AAG AGU AAC AGC UC…-3’ szekvencia-részlettel kezdődik. Tartalmazza a partitivírusok 5’

UTR-jeire jellemző CAA és CAAAA ismétlődő szekvenciákat (Strauss és mtsai., 2000). Az adenozinban és uracilban gazdag, 64 nt hosszúságú 3’ nem transzlálódó régió (3’ UTR) az ORF-t követően helyezkedik el. A dsRNS1 molekulát egy 22 nt hosszúságú adenozin véget is tartalmazó szekvencia zárja. A BCV1 dsRNS1 szekvenciát a GenBank nemzetközi adatbázis-ban az EU489061 azonosító szám alatt helyeztük el.

Natalya Enünlü a BCV1 cDNS-klónok analízise során meglepetésre azt találta, hogy azok egy gyűrű mentén is elrendezhetők, vagyis a genomi dsRNS1 valószínűleg cirkuláris formát is felvehet (Enünlü és mtsai., 2003). A cirkuláris dsRNS molekulát 1721 bp alkotja, az 1677 bp hosszúságú nyílt leolvasási kerete, mely a lineáris dsRNS1 molekulával megegyező

frame-ben helyezkedik el, 559 aminosavból álló RNS-függő RNS-polimerázt kódol (21. áb-ra). A cirkularizáció meglétét egy független kísérletben, Mars fajtájú cukorrépából izolált tel-jes nukleinsav kivonatban is ellenőriztük. Az intergénikus régió amplifikálásához a részleges RDRP-szekvencia N- és C-terminális végeihez kötődő primereket (NP04 és NP05) használ-tunk és sikerült az elvárt, 225 bp méretű terméket amplifikálnunk, ami kizárólag cirkularizáció esetén lehetséges (Ilyés, 2006). Annak az eldöntéséhez, hogy a cirkuláris szer-kezet a különböző mintákban domináns vagy csak a molekulák kis hányadában fordul elő, további kísérletek elvégzése szükséges. Az irodalomból viszont ismeretes, hogy a cirkularizációt számos vírus alkalmazza RNS-einek stabilitásának, és ezáltal fennmaradásának nagyban fokozására (Jian és mtsai., 1998).

BCV1

21. ábra: A BCV1 RdRp-t kódoló dsRNS1 szegmenséből a N. Enünlü által előállított cDNS-klónok cirkulárisan rendezhetők el. Az ábrán nem kódoló régió amplifikációjára al-kalmas NP04-NP05 primerpár helyét, néhány restrikciós helyet és a cirkuláris cDNS kialakításához használt klónok elhelyezkedését jelöltünk be (N. Enünlü kí-sérletei és ábrája szerint).