Az NFAP2 hatásmechanizmusának mikroszkópos vizsgálata

Az NFAP2 antifungális hatását mid-log fázisú S. cerevisiae SZMC 0644 sejtekkel szemben mikroszkópos technikákkal vizsgáltuk, 24 óra inkubáció után, a fehérje letális (0,195 μg/ml) és szubletális (0,098 μg/ml) koncentrációban történő alkalmazásával. Az élesztősejtekben az antifungális protein jelenlétében végbemenő fiziológiai változásokat FUN1 és PI festéssel (Thermo Fisher Scientific) és Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit-tel (Sigma-Aldrich) követtük nyomon.

Az NFAP2 a S. cerevisiae SZMC 0644 metabolikus aktivitására kifejtett hatását FUN-1 fluoreszcens festékkel vizsgáltuk a fehérje szubletális koncentrációban történő alkalmazása során. Ez a festék passzív diffúzióval képes bejutni a citoplazmába és ott a metabolikusan aktív vakuólumokat pirosra, míg a metabolikusan inaktívakat zöldre festeni.

A S. cerevisiae SZMC 0644 metabolikus aktivitásában, a piros és zöld vakuólumok aránya alapján, a kezelt és kezeletlen minták között nem volt megfigyelhető változás még 16 órás NFAP2 kezelést követően sem (nem közölt adatok).

A S. cerevisiae SZMC 0644 törzs esetében a szubletális koncentrációban alkalmazott NFAP2 hatására bekövetkező apoptótikus és nekrotikus eseményeket Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit-tel vizsgáltuk. Ez a kit két festéket tartalmaz: a fluoreszcein-izotiocianát (FITC) kromofórral konjugáltatott Annexin V-öt és a PI-t. Az Annexin V-FITC az apoptózis korai szakaszában a sejtmembrán intracelluláris oldaláról az extracelluláris felszínére transzlokálódott foszfatidil-szerinhez kötődik és a sejtet zöldre festi. A PI nem jut át az intakt sejtmembránon, azonban a membrán integritásának megszűnése után bejut a sejtbe és a DNS-hez kötődve azokat pirosra festi. Vizsgálatunk során a szubletális koncentrációjú NFAP2-vel kezelt és kezeletlen mintákban nem volt szignifikáns különbség a zölden festődött sejtek aránya (az összes sejtszám kb. 1%-a) között még 16 óra inkubáció után sem. Ehhez hasonlóan a rövid idejű (10, 30 és 60 perces) NFAP2 kezelést követően a PI-dal festődött sejtek aránya (az összes sejtszám kb. 1%-a) is megegyezett a kezelt és a kezeletlen mintákban. Tizenhat óra inkubációt követően azonban, a kontrollhoz képest háromszor több piros festődést mutató sejt volt megfigyelhető a fehérje-kezelt mintában, ami

67 statisztikailag szignifikáns különbséget jelent (p = 0,00004). Ezek a megfigyelések arra engedtek következtetni, hogy az NFAP2 nem változtatja meg az élő sejtek metabolikus aktivitását és apoptózist sem indukál, viszont plazmamembrán roncsoló hatása lehet.

Az NFAP2 plazmamembrán roncsoló hatását PI festés alkalmazásával vizsgáltuk a fehérje szubletális és letális koncentrációban történő használata során. Hat órán át tartó inkubációt követően, az eddig tapasztalt megfigyelésekhez hasonlóan, a pirosan festődött sejtek száma megegyezett a kezeletlen és a szubletális koncentrációjú NFAP2-vel kezelt mintákban. Ugyanakkor, 16 óra inkubációt követően a kezeletlen kontrollban a teljes sejtszám 6%-a, míg az NFAP2-kezelt mintában a sejtek 18%-a volt PI-pozitív (13/A és C ábrák). A letális koncentrációjú NFAP2 esetében már 10 perces inkubációt követően szignifikáns különbség volt megfigyelhető a kontroll és a kezelt mintákban jelenlévő piros fluoreszcenciát mutató élesztősejtek száma között (13/B és C ábrák). Tizenhat óra elteltével pedig a kezelt mintában már nem volt megfigyelhető életképes sejt (13/C ábra).

Eredményeink azt jelzik, hogy az NFAP2 antifungális hatásmechanizmusának hátterében plazmamembrán roncsoló hatás állhat, ami dózis és időfüggő.

Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a cgAFP-khez hasonlóan az NFAP2 is dózisfüggő módon fejtette ki antifungális hatását az érzékeny gombaizolátumokkal szemben (Kaiserer és mtsi., 2003; Marx, 2004). Szubletális koncentrációban alkalmazva az NFAP2 növekedésgátló hatású volt, azonban magasabb koncentrációban ez a hatás már fungicid jellegűvé vált.

A szakirodalomban leírt cgAFP-k fajspecifikus hatást mutatnak és antifungális spektrumuk nagyon eltérő lehet (Marx, 2004).Ezek a fehérjék elsősorban mezőgazdasági és egészségügyi szempontból jelentős patogén fonalasgombákkal szemben mutatnak növekedésgátló hatást (Lacadena és mtsi., 1995; Lee és mtsi., 1999; Geisen, 2000; Theis és mtsi., 2003; Kaiserer és mtsi., 2003; Marx, 2004; Moreno és mtsi., 2003, 2006; Meyer, 2008;

Barna és mtsi., 2008; Galgóczy és mtsi., 2005, 2007, 2008; Kovács és mtsi., 2011; Virágh és mtsi., 2014). Az AnAFP, az FPAP és a BP viszonylag magas koncentrációtartományban fejtettek ki antifungális hatást Candida fajokkal és S. cerevisiae-vel szemben (Lee és mtsi., 1999; Seibold és mtsi., 2011; Galgóczy és mtsi, 2013). Kísérleteink során már az alacsony koncentrációban alkalmazott NFAP2 is teljes növekedésgátlást eredményezett a vizsgált, súlyos bőr-, nyálkahártya- vagy szisztémás fertőzés kialakulásáért felelős C. albicans és más, NAC klinikai izolátumok esetében, ugyanakkor az NFAP-val ellentétben, a

68 fonalasgombák rezisztensnek bizonyultak a fehérjével szemben (Kovács és mtsi., 2011) (7.

táblázat).

13. ábra. A S. cerevisiae SZMC 0644 PI-vel történő festése 16 órán át tartó, 30 °C-on történő, szubletális koncentrációban (0,098 µg/ml) (A) és 10 perces, 30 °C-on történő, letális koncentrációban (0,195 µg/ml) alkalmazott NFAP2-kezelés után (B). A piros festődés membránkárosodást jelez. K: kezeletlen kontroll, NFAP2: NFAP2-kezelt sejtek. Méretskála: 20 µm. A PI-pozitív S. cerevisiae sejtek aránya szubletális és letális koncentrációban alkalmazott NFAP2-kezelt és kezeletlen mintákban eltérő időtartamú, 30 °C-on történő inkubációt követően (C).A szignifikancia-értékeket (p-érték) a kezeletlen kontrollokhoz viszonyítva határoztuk meg. ***p<0,0001, **p<0,005, *p<0,05, ns: nincs szignifikáns különbség.

69 A mikroszkópos vizsgálatainkat a fonalasgombákkal szemben hatékony NFAP kapcsán a szakirodalomban leírt hatásmechanizmussal összevetve elmondhatjuk, hogy a rövid időtartamú NFAP-kezelés csökkent metabolikus aktivitást és apoptózis indukciót vált ki az arra érzékeny A. nidulans-ban, a plazmamembránt viszont nem károsítja (Virágh és mtsi., 2015). Ezzel szemben az élesztőgomba-ellenes NFAP2 rövid időtartamon belül nem indukál apoptózist és nem okoz változást a metabolikus aktivitásban, viszont roncsolja a plazmamembránt, ami a hatásmechanizmusának fő eleme lehet. Ez utóbbi igazolására és a pontos hatásmechanizmus feltárására azonban további kísérletek szükségesek. A szakirodalomban számos növényi és humán kationos antimikrobiális peptid esetében már leírtak C. albicans és nem-albicans sejteken kifejtett plazmamembrán roncsoló aktivitást (Nawrot és mtsi., 2013; Swidergall és Ernst, 2014). Továbbá megfigyelték, hogy az antimikrobiális proteinek plazmamembrán roncsoló képessége szorosan összefügg a fehérjében jelenlévő arginin és lizin aminosavak számával, amik a molekulát pozitívan töltötté teszik (Lee és Lee 2015; Tam és mtsi., 2015). Ezek alapján feltételezhetjük, hogy az NFAP2 plazmamembrán roncsoló hatásáért is a hét lizin aminosav jelenléte miatt kialakuló nagymértékű pozitív töltés (nettó töltés pH 7,0 = +5,2) tehető felelőssé.