Az iszkémiás károsodás mértékének megítélése

Az iszkémia következtében kialakuló izomkárosodás mértékének gyors és pontos megállapítása tehát a fent leírtak tekintetében kiemelt jelentőségű. A jelenleg rendelkezésre álló módszerek közül azonban csak kevés rendelkezik ezzel a potenciállal.

2.4.1 Az izomkárosodás mértékének megállapítására alkalmas módszerek

Az izomkárosodás mértékének megállapítására számos morfológiai és funkcionális, kvalitatív és kvantitatív eljárás áll rendelkezésre. Ilyenek módszerek a fény-⁶⁰ és elektronmikroszkópos változások detektálása,⁶¹ ezek szemikvantitatív kiértékelése különböző score rendszerek segítségével,⁶² a sejtek energiaháztartásának,¹³ illetve sav-bázis egyensúlyának vizsgálata,⁶³ redox-homeosztázis értékelése,⁶⁴ kapilláris permeabilitás vizsgálata,⁶⁵ kontraktilitást megítélő próbák,⁶⁶ illetve a mitokondriumok funkcióképességét megítélő technikák.⁶⁷

A fent említett eljárások jelentős része azonban az iszkémia ideje alatt nem alkalmazható a károsodás mértékének megítélésére, hiszen a vizsgált paraméterek jelentős része csak a reperfúzió során válik detektálhatóvá, mely a szisztémás szövődmények prevenciója szempontjából nem megfelelő.

Az iszkémia okozta izomkárosodás megítélésére azok a módszerek optimálisak, melyek a sejtek energiaháztartását vizsgálják, hiszen ahogy már a korábbi fejezetekben említettük az energiaraktárak kimerülése sejthalál egyik legfontosabb kiváltó tényezője.¹³ Megfelelően magas koncentrációjú ATP jelenléte a revaszkularizáció során elengedhetetlen a sejtek túlélése szempontjából, ennek hiányában a sejten belüli restitúciós folyamatok működésképtelenné válnak, sejthalál következik be.

Szívizomsejteken végzett vizsgálatok szerint a sejten belüli ATP koncentráció csökkenése jól jelzi károsodás mértékét, továbbá egy 80-90%-os ATP-szint csökkenés sejtnekrózishoz vezet.⁶⁸

A sejtek ATP koncentrációjának biokémiai meghatározása a humán klinikai gyakorlatban azonban nem alkalmazható eljárás, a folyamat időigényes voltára való

tekintettel. Az energiahordozók koncentrációjának direkt meghatározása mellett, illetve helyett éppen ezért a celluláris energia-szint indirekt vizsgálatára alkalmas eljárások jelenthetik az igazi megoldást.

2.4.2. A sejtek energiaszintjének indirekt meghatározása

A mitokondriumok, mint a sejtek energiatermelő egységei, az ATP szintéziséért felelősek, károsodásuk esetén nem keletkezhet elégséges mennyiségű ATP, így a sejtek túlélése sem biztosítható.⁶⁹ Iszkémia során a mitokondriális légzési lánc aktivitása csökken, mely aktivitás-csökkenés enzim-kémiai módszerek segítségével rövid idő alatt kimutatható, hiszen az alkalmazható reakciók gyors lefolyásúak.

Az enzim-kémiai reakciók alapját a különböző tetrazolium sók alkalmazása képezi. Ezen sók a terminális oxidáció enzimeinek működését képesek kimutatni, a megfelelő szubsztrát adagolásával. A működő enzim-komplexek a tetrazolium sókat redukálják, ezzel színes reakciótermék (formazán) keletkezik.⁷⁰ A sejtpartikulumok károsodása, lízise esetén a belső membránban helyet foglaló oxidációs enzim-komplexek működése megszűnik, így nem képesek a tetrazolium sók hasítására, tehát a festődés elmaradása a mitokondriumok károsodását jelzi.⁷¹ A tetrazolium sókkal történő makroszkópos festődés megszűnése jól korrelál a nekrózis jelenlétével.¹⁰

Meg kell jegyeznünk azonban, hogy a tetrazolium sók átalakulása nem teljesen mitokondrium specifikus. Kis

mennyiségben ugyan, de az endoplazmatikus retikulumban is képződhet színes reakció termék, valamint a keletkezett színes formazán lipidoldékony, így lipidekben gazdag szövet esetében (pl. zsíros degeneráció esetén) kisebb-nagyobb mennyiségű álpozitivitással számolni kell.⁷⁰

Számos tetrazólium vegyület létezik, melyek közül a legspecifikusabb (alacsony redox potenciál és lipidoldékonyság), tehát a legalkalmasabb az iszkémiás károsodás

9. ábra: A nitroblue tetrazolium

mértékének meghatározására a 2,2p-di-p-nitrofenil-5,5r-difenil-3,3t-(3,3'dimetoxi-4,4'-bifenilén)ditetrazolium-diklorid az ún. „nitroblue tetrazolium” (9. ábra).⁷⁰

Ahhoz azonban, hogy a reakció a klinikai gyakorlatban elismert módszerként hasznosíthatóvá váljék, a keletkezett reakciótermék mennyiségét valamilyen kvantitatív technika segítségével számszerűsíteni is szükséges.

2.4.3. Kvantitatív módszerek

A tetrazolium reakciók számszerűsítésére különböző technikák léteznek, melyek ugyan jelen formájukban a klinikai alkalmazásra nem alkalmasak, azonban megfelelő alapot jelenthetnek egy új technika kifejlesztéséhez. egy kalibrációs egyenes segítségével a kapott abszorbancia értékből meghatározható,

kvantitatív eredményt biztosítva (10. ábra). A keletkezett reakciótermék koncentrációjának csökkenése a károsodás mértékét jól jelzi.⁷⁴ A módszer klinikai alkalmazhatóságát nehezíti, hogy az eljárás mindeddig kizárólag revaszkularizációt követően került kipróbálásra. Egy másik limitáló tényező az előkészítési idő, sajnálatos módon az eljárás minta-preparációs ideje jelenleg jóval hosszabb a klinikailag elfogadhatónál.

10. ábra: Az abszorbancia vizsgálata A vizsgálat során az oldalot meghatározott (a vizsgálni kívánt oldott anyag tulajdonságától függő) hullámhosszú fénnyel világítjuk meg, melynek egy részét az oldott anyag koncentrációfüggően elnyeli. A fény intenzitásából (a kezdeti intenzitás ismeretének függvényében) az oldott anyag koncentrációja kiszámolható. Forrás:

http://www.public.asu.edu/~laserweb/woodb ury/classes/chm467/bioanalytical/spectrosco py/absflr.html

Egy másik kvantifikációs módszer a szívizomszövetben is gyakran alkalmazott ún. planimetria.⁷⁵ A technika lényege: az izmot, vagy annak egy megfelelő méretű darabját tetrazólium sót tartalmazó festékbe mártjuk, a szövet a festéket diffúzióval felveszi, majd a mitokondriumok a tetrazólium sót átalakítják, mely makroszkóposan láthatóvá válik, az izom elszíneződik. A károsodott területek a fent részletezett okok következtében a tetrazólium reakció kivitelezésére képtelenek, így ezen

területek nem mutatnak színreakciót. A mintán ezek után meghatározásra kerül a reakciót nem mutató régiók aránya, a minta teljes területéhez képest (11. ábra). Ezen technika nagy előnye a gyorsaság, a vizsgálat már a klinikai gyakorlat számára is elfogadható időn belül kivitelezhető. A módszer hátránya viszont, hogy a megfelelő szenzitivitás eléréséhez nagy mennyiségű szövetmintára van szükség, ami a klinikai gyakorlatban elfogadhatatlan.

Ugyan az ismertetett módszerek a betegágy melletti diagnosztikához jelen formájukban nem alkalmasak, mindkét technika esetében bebizonyosodott, hogy az általuk nyert eredmények jól korrelálnak az ultrastrukturális változásokkal.⁷¹ Egy ezen eljárásokon alapuló, megfelelő kvantifikációs technika kifejlesztése azonban megoldást hozhat az izomkárosodás mértékének klinikai gyakorlatban is megvalósítható meghatározására.