I/4.1. Bevezetés
Az ELISA a WB-tal ellentétben könnyen betanítható, automatizálható, standardizálható, ob-jektív, számszerű eredményt ad ki, viszont nem képes elkülöníteni a specifikus immunválaszt az aspecifikustól. Az volt a célom, hogy egy olyan eljárást fejlesszek ki, amely képes a két eljárás előnyeit egyesíteni. Munkatársaim segítségével ezért fejlesztettem ki az AIR-t.
I/4.2. Anyag és módszer
A WB fejezetben leírt blottokat használtam a feladat kiinduló pontjaként (44. oldal, I/27. áb-ra). Olyan blottokat válogattam össze, ahol a gyakorlatban előforduló valamennyi technikai hiba előfordult. Például, ha buborék kerül a blottolás során a rétegek közé, akkor a bandek a buborékhoz közeli széle sötétebb, másutt világosabb lesz. Az ELFO során is torzulhatnak a bandek, a széli részeken a futás törvényszerűen lassabb (az ELFO „mosolyog”), és a futtatás néha hosszabbra, máskor rövidebbre sikerül. A bandek előhívása is változó, de attól még a halványabb és a sötétebb blottok is értékelhetőek, szemünk könnyedén elvégzi a korrekciót, de a számítógépet ezekre meg kell tanítani.
A blottokat egy átlátszó fóliával papírlapra ragasztottam, így egyrészt megvédtem a poroso-dástól, másrészt erőteljesebbé tettem, hogy alkalmassá tegyem a szkenneléshez. Kifejlesztet-tem egy digitalizáló berendezést, ami egy szenzor révén automatikusan húzza be a papírlapot, megtalálja a vizsgálatra szánt mintát, és külön beavatkozások nélkül automatikusan végzi el a digitalizálását (I/67.ábra). A korábban alkalmazott torma-peroxidáz helyett alkalikus foszfatázzal conjugált anti-human immunglobulin használatára tértem át, mert ennek a szubsztrátja a BCIP/NBT, ami jóval stabilabb színreakciót adott, mint a korábban használt diamino-benzidin-tetrahidroklorid (DAB), ennek megfelelően a mérések ismétlése, az ered-mények reprodukálhatóságának a vizsgálata megoldhatóvá vált. A digitalizálást követő fel-dolgozást több, szabadon hozzáférhető számítógépes program egymásra építésével oldottuk meg. Ezt a feladatot Radványi András, később Deák L. Csaba végezte. Ezeket a programokat, megoldásokat itt nem részletezem.
I/67. ábra. A szkennert úgy alakítottuk ki, hogy egyszerre csak egyetlen, 26 mintát hordozó blot képét dolgozza fel.
I/4.3. Az AIR működése
A berendezés leírásához részletes dokumentáció és használati utasítás tartozik. Ehelyütt csak az AIR működési alapelvét, a legfontosabb megoldásokat összegzem. Az I/68. ábra felső ré-szén az etalon (standard kontroll), látható, ami egy korábban digitalizált kontrollminta képé-ből derivált denzitási görbe. Az antitestválaszok “A” - “S” alatt a számok az egyes Borrelia antigének molekulasúlyát jelentik kDa-ban. A 13. pozícióban beállított referencia (aktuális, tehát a most digitalizált blottlemez kontrollja) némileg eltérő képéhez a gép automatikusan illeszti a megfelelő molekulasúlyokat.
I/68. ábra. A kép felső részén a standard kontroll (etalon) látható, ami a pozitív kontrollminta egy korábbi szkennelés eredmé-nyeképpen született digitalizált képe. Ezt használjuk valamennyi későbbi blotlemez elemzéséhez, ehhez viszonyítjuk az aktuális pozitív kontrollt (referenciát), ami ugyanannak a savómintának egy újabb vizsgálata. Ez törvényszerűen eltér valamennyire az etalontól. Itt látható, hogy a futási hosszúságban van különbség, a referenciában az A és az S bandek között nagyobb a távol-ság, mint az etalonban. A gép automatikusan megtalálja az etalon alapján a némileg eltérő referencia megfelelő molekulasúlyú bandjeit. Az ábra felső részén a betűjelek alatt látható számok mutatják az adott bandek molekulasúlyát kDa-ban. A legalsó sorban az aktuális referencia eredeti képe látható.
Amennyiben az etalon digitalizált képéből derivált denzitási görbe alapján a referencián meg-határozott molekulasúlyokban tévedést tapasztalunk, mód van kézi korrekcióra is. Pon-tosíthatjuk az egyes denzitás-maximumok helyét és beállíthatjuk a molekulasúlyokat is, amit egyébként a gép folyamatos integrálszámításokkal automatikusan is megad (I/69. ábra). A program automatikusan levonja a háttérzajt. Így különböző erősségű festődés esetén is azonos eredményeket kapunk.
I/69. ábra. Hibásan értékelt referencia. A K és a P pozícióban talált band molekulasúlya eltér az etalonétól, kézi korrekcióra van szükség.
Első lépésben a gép a referencia (“R”=13-as pozíció) alapján megítélt molekulasúlyokkal (band) párhuzamos vonalak mentén keresi a vizsgálati mintákban (1-12 illetve 14-26) a meg-felelő bandeket. Az ELFO során azonban a bandek kisebb-nagyobb mértékben elcsúszhatnak.
A gép automatikusan helyreigazítja az eltéréseket. A felhasználó több különböző nézetben is korrigálhatja a gép által felajánlott „szintvonalakat”.
I/70. ábra. A nyilakkal jelölt területeken a program először nem találja meg a bandeket. Ezután a gép automatikusan korrigál, ennek megfelelően (a beállítástól függően) az összes többi szintvonal is elmozdul, arányosan követve az ELFO torzulásait.
Adott esetben az egérrel is végezhetünk korrekciót, akár pontonként, akár szintvonalanként.
A megtalált bandek denzitását megmérve és összegezve a kép jobb oldalán számszerű értéke-ket kapunk (I/71. ábra). Ez az érték hasonlít az ELISA-val kapott értékekhez, hiszen a specifi-kus és az aspecifispecifi-kus reakciókat együtt mérjük. Már itt is megmutatkozik azonban a háttérzaj kikapcsolásának az előnye.
I/71. ábra. Az előző kép a korrekció után. Most már a szintvonalak a megfelelő bandeken húzódnak át, ezeken a pontokon végezzük el a mérést, aminek a számszerű értékei a kép jobb oldalán láthatók.
Az I/2. fejezetben leírtam, hogyan választottam ki a legspecifikusabb antitesteket (I/31. ábra, 49. oldal). A továbbiakban csak ezek denzitását vizsgálom, emiatt a rendszer specificitása tovább növekszik (I/72. ábra).
I/72. ábra. Csak a specifikus bandeken áthaladó szintvonalak metszéspontjaiban mérünk. Ezek összege látható a kép jobb oldalán.
I/4.4. Megbeszélés
Az AIR lényege, hogy képalkotó számítógépes programmal megkeressük a WB vizsgálatok során keletkező bandeket, meghatározzuk, hogy melyik band, milyen molekulasúlynak felel meg, és megmérjük a bandek intenzitását. Ezt az eszközt akkor találtam ki, amikor hasonlóról a Lyme diagnosztikában – úgy tudom, hogy – addig még nem jelent meg közlemény. Az AIR segíthet az eljárás standardizálásában, hiszen kikapcsolja a vizsgáló szubjektivitását, ami a WB leolvasásánál egyébként elkerülhetetlen. Módot ad, hogy leleteinkben számszerű értéke-ket adjunk meg, ami az egyes eredmények összehasonlítását lehetővé teszi. Így a Lyme diag-nosztikában kevésbé járatos kollégák számára is értelmezhetővé teszi az eredményeket. Mind a mai napig az ajánlásokban csak a bandek számával kalkulálnak, és figyelmen kívül hagyják azok intenzitását. Ez azt jelenti, hogy a vizsgálat egyik fontos eredményét negligálják. Ez a súlyos hiba vezetett a kétlépcsős protokoll kifejlesztéséhez. A kétlépcsős protokollban egy ELISA-val végeznek szűrővizsgálatot, és csak azokat a mintákat vizsgálják tovább WB-tal, amelyek legalább határértékű eredményt adtak. Bár a kétlépcsős protokoll általánosan elfoga-dott, maga az eljárás csak akkor segítene a vizsgálatok minőségének a javításában, és általá-ban a vizsgálatok standardizálásááltalá-ban, amennyiben pontosan megadnák, hogy milyen szenziti-vitási / specificitási paramétereket kell teljesítenie az ELISA-nak, illetve a WB-nak. Ilyen ajánlásokról azonban nem tudok. A kétlépcsős protokollt azért találták ki, hogy ne fordulhas-son elő, hogy a járatlan leolvasó az egészen halvány bandeket is „pozitívként” értékeli. Tehát az ELISA feladata az lenne, hogy legalább a legnegatívabb mintákat kiszűrje, azokat ne lehes-sen pozitívként értékelni a WB-tal. Könnyű belátni, hogy attól még a szuper szenzitív (hiszen az is cél, hogy egyetlen fertőzött se hulljon ki a rostán) ELISA-val kiszűrt minták jelentős része hamis pozitív, így a szubjektív hiba, tehát hogy halvány bandeket is pozitívnak értékel a leolvasó, bár némileg kedvezőbb arányban, de még fennáll. Az előszűrés csökkenti ugyan a hamis pozitívak arányát a szűrővizsgálat specificitásának a függvényében, de ahogy korábban láttuk, néhány százalékos hamis pozitivitás már csaknem használhatatlanná teszi a Lb-ban a szerodiagnosztikát (lásd 31-33. oldal, I/24. ábra). A feladat tehát az lenne, hogy a negatív minták kiszűrését a WB vizsgálaton belül, egy lépésben oldjuk meg, tegyük objektívvé a leol-vasást. Ezért fejlesztettük ki az AIR-t.
Az AIR – előre programozhatóan – csak egy bizonyos intenzitású bandet értékel, képes elkü-lönítve számolni a kevésbé és a nagyon specifikus bandek intenzitásával, sőt akár minden
tői rendszerként is funkcionálhat, hiszen 87% találati biztonsággal konkrét diagnózist is java-solhat. (A 13% “hiba” abból adódik, hogy a fertőzés első heteiben még nem mutatható ki im-munválasz.) Tudomásom szerint a munkatársaim segítségével a világon először fejlesztettünk ki automatikus immunoblot elemző rendszert, mely nemcsak a Lb, hanem más, összetett fe-hérjestruktúrával rendelkező mikrobák okozta infekciók vizsgálatában, tehát különösen a bak-teriális szerodiagnosztikában lehet használható. Segítségével lehetővé válik a teljes WB vizs-gálat automatizálása. Egy ELISA readerhez képest a szükséges beruházás költsége elhanya-golható, a vizsgálat specificitása jelentősen növelhető.
I/4.5. Összefoglalás
Az AIR egyesíti az ELISA és a WB előnyeit. A WB-tal szemben az ELISA automatikus, standardizálható és objektív, a WB viszont csak a specifikus antigénekkel szembeni antitest-válaszokat veszi figyelembe. A Lb diagnosztizálásában a nagyszámú aspecifikus, keresztreak-ciót adó antigén miatt a specifikus antitestválasz kimutatására a WB előnyösebb, mint az ELISA. A WB leolvasása azonban szubjektív, és ez lehetetlenné teszi az eljárás standardizálá-sát. Az ELISA mennyiséget mér, míg az érvényben lévő ajánlások szerint a WB csak a bandek számát vizsgálja, de a bandek intenzitását nem.
Az AIR-rel a WB során keletkezett képet digitalizáljuk, meghatározzuk a standard kontroll (etalon) fehérjéit. Minden 26 vizsgálat három IgG pozitív kontrollt tartalmaz, ebből az egyik a referencia. A számítógépes program morfológiai alapon felismeri a referencián az etalonnak megfelelő molekulasúlyú Borrelia-fehérjéket, elkülöníti a specifikus antitesteket, majd auto-matikusan megkeresi a tesztsavók megfelelő antitestjeit, megméri azok az etalonhoz viszonyí-tott intenzitását, levonja a háttérzajt, és számszerű eredményt ad. Ennek megfelelően objektív, standardizálható. Az AIR további nagy előnye, hogy általa az előző fejezetben ismertetett COMPASS standardizálható, az eredményei statisztikailag feldolgozhatók. Ez a feldolgozás jelenleg is folyik.