AtMPK6 és feltételezett szubsztrátjai

A növények növekedésére mind környezeti, mind fejlődési stimulusok is hatással vannak, szabályozzák a sejtosztódást, a differenciálódást és a citoszkeleton elrendeződését [101]. Amellett, hogy a MAPK-ok célfehérjéi főként transzkripciós faktorok, szabályoznak citoszkeletális fehérjéket is. Növényekben mindeddig csak néhány MAPK szubsztrátot azonosítottak, citoszkeletális fehérjék foszforilációjáról pedig kevés ismeretünk van [102].

A MAPK jelátvitel és a citoszkeleton kapcsolata létrejöhet citoszkeletális fehérjék direkt foszforilációjával, illetve a citoszkeletális fehérjék szerepelhetnek állványfehérjeként a MAP kinázok és azok aktivátorai, szubsztrátjai között [103]. Állati és élesztő sejtekben számos példát találunk MAPK-ok és mikrotubuláris fehérjék kölcsönhatására. Élesztőben kimutatták, hogy a mikrotubulus átrendeződést MAP kinázok regulálják ozmotikus stressz esetén [104]. Megállapították továbbá, hogy sertés oocitákban a kinetochor és MAPK-ok kapcsolatban állnak [105], illetve, hogy aktív ERK-ek játszanak szerepet a mikrotubulusok elrendeződésében egér oociták érése során [106]. Habár a növényi MAPK-ok szerepe intenzíven tanulmányozott csak néhány mikrotubuláris fehérje azonosított, mint kölcsönható partner, illetve szubsztrát:

Arabidopsisban a MAP65-1, MAP65-2, MAP65-3 [53], dohány növényben pedig a MAP65-1a/b [101].

A mikrotubulusok falát az α- és a β-tubulin alegységekből álló polipeptidek alkotják. A sejtekben előfordul még egy harmadik tubulin típus a γ-tubulin (14. ábra). A γ-tubulin a mikrotubulus térbeli rendezettségének kialakításában játszik fontos szerepet, oly módon, hogy a negatív végéhez kapcsolódik, így segíti a mikrotubulusok beágyazódását a centroszóma anyagába. Így egyrészt az egész mikrotubuláris apparátus

36

polaritásra tesz szert (növekvő végek kifelé néznek), másrészt pedig a negatív végek stabilizálódnak, azaz az asszociáció/disszociáció gátlódik.

Az EB1 (pozitív vég kötő fehérje 1) egy mikrotubulus-asszociált fehérje, mely a sejtosztódás interfázisa során a mikrotubulus pozitív végéhez köt és az anafázis promótáló komplexszel (APC) is kölcsönhat [107]. Kimutatták azt is, hogy mikor az endoplazmás retikulum depletált Ca²⁺ szintjének következtében az ERK1/2 aktiválódik és foszforilálja a STIM1-et (sztrómális kölcsönható fehérje 1), minek következtében a STIM1 ledisszociál az EB1-ről [108]. Az EB1c az EB1 fehérjék növényspecifikus formája, az EB1a-val és az EB1b-vel ellentétben található benne prediktált MAPK kötő motívum és foszforilációs hely is.

14. ábra. A mikrotubulus sematikus szerkezeti képe. A γ-tubulin zöld színnel, a GCP4 fehérje barna színnel, az EB1 pedig sárgával látható.

A GCP4 (γ-tubulin komplex fehérje 4) a γ-tubulin komplex része, és valószínűleg a mikrotubulusok elágazásainak létrehozásában játszik szerepet [109]. A GCP4 fehérjében is található prediktált MAPK foszforilációs hely és kötő motívum.

Együttműködő partnereink a növényi sejtosztódás egyes szakaszait vizsgálva in vivo és in vitro kísérletekkel kimutatták, hogy az aktív AtMPK6 kölcsönhat a γ-tubulinnal és az EB1c-vel. Utóbbiban azonosítottak egy tirozin foszforilációt, mely λ-foszfatáz hatására eltűnik és MAP kináz gátló MKK inhibitor hatására ezen

37

foszforiláció mértéke csökken. Emellett megállapították, hogy a növényi mikrotubulusokhoz a γ-tubulin, a GCP4, az EB1 fehérjék és az aktív AtMPK6 is kapcsolódhat [110]. Így felmerülhet a kérdés, hogy az AtMPK6 szubsztrátjaiként foszforilálja-e ezen fehérjéket.

2.3.1. In vitro transzláción alapuló kináz szubsztrát azonosítás

A humán genom 500 kinázt tartalmaz [111], míg Arabidopsisban több mint ezer kináz található [112], így nem meglepő, hogy a kináz szubsztrát azonosítás egyik központi témája a biokémiai és a gyógyszerészeti kutatásoknak. Annak ellenére, hogy az azonosított kinázok száma egyre nő, a legtöbb szubsztrátjuk még nem ismert.

Belátható, hogy ezen kináz-szubsztrát kölcsönhatások azonosítása elengedhetetlen a jelátviteli útvonalak pontos feltérképezéséhez. Egy kináz fiziológiás szubsztrátjának felderítése különféle módszereket alkalmazó, összetett biokémiai, sejtbiológiai feladat, amely két okból is kihívást jelent. Elsősorban, a legtöbb kináz és szubsztrát fiziológiásan csak kis mennyiségben fordul elő a sejtben, a kinázok affinitása szubsztrátukhoz pedig viszonylag gyenge. Ezen limitációk következtében a kináz-szubsztrát komplex vagy a célfehérje kivonása gyakran megvalósíthatatlan.

Másodsorban, az eukarióta multidomén fehérjék gyakran nem termeltethetők hatékonyan E. coli alapú fehérje expressziós rendszerben, zárványtesteket alkothatnak.

Annak ellenére, hogy számos előrelépés történt a prokarióta fehérje előállítás terén és a különféle humán sejtvonalak is használhatóak rutin fehérjetermelésre, a sejtmentes in vitro transzláció egy hiánypótló módszerként alkalmazható aktív rekombináns kinázok előállítására [113]. Az in vitro transzlációs rendszerek előnyeit részletesen a 2.1.3. fejezet mutatja be.

Hogy bebizonyítsuk egy fehérjéről, hogy valóban szubsztrátja egy adott kináznak, in vitro foszforilációs reakciót kell végeznünk. A kináz reakciónak két hagyományos módja ismert: egyik a radioaktív γ-foszfátot tartalmazó ATP használatával a másik pedig foszfoaminosav specifikus antitesteken alapszik. Habár mindkét módszer nagy érzékenységű és jól leírt, az első esetében speciális laboratóriumra van szükség, illetve veszélyes anyaggal kell dolgoznunk, utóbbi módszer alkalmazhatósága pedig az időtényezőn és az antitest minőségén alapul. A kereskedelmi forgalomban kapható, foszfospecifikus festék alkalmazása egy vonzó alternatívát jelenthet a foszfoszerint,

38

foszfotirozint és foszfotreonint tartalmazó aminosavak PAGE gélben történő kimutatásában [114].

Laboratóriumunkban optimalizáltuk az in vitro transzláción és kináz reakción alapuló szubsztrát azonosítást, az AtMPK6 feltételezett szubsztrátjait ezen technikákkal kívántuk igazolni [113].

39